涼粉草是一種傳統藥食兩用植物，生長于中國東南部、東南亞和印度東北部。因其在中國古代民間醫(yī)學中享有盛譽，可治療多種疾病，因此也被稱為“神草”。根據中藥藥典，涼粉草天然富含生物活性多糖和多酚，可用于治療中暑，保護肝功能。涼粉草多糖（MCP）是一種棕色酸性陰離子雜多糖，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖和半乳糖醛酸組成。由于天然結合的棕色生物活性物質（例如多酚和有機酸），這些多糖呈現棕色。MCP與這些生物活性化合物的組合，稱為MCP復合材料(MCPC)，表現出許多健康益處。
MCPC的研究主要集中在宏觀水凝膠，而不是微米或納米凝膠。然而微型水凝膠（微凝膠）比宏觀水凝膠具有更可控的吸收和響應釋放特性。對腸-肝軸的研究表明，口服益生菌參與庫普弗細胞調節(jié)、內毒素易位和腸源性代謝物遷移，有助于在肝損傷中發(fā)揮保肝作用。益生菌Akkermansia muciniphila(AKK)通過調節(jié)腸道菌群的組成和代謝功能并激活磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt通路，從而改善藥物引起的氧化性肝損傷?；畹腁KK或雙歧桿菌比巴氏滅菌形式對肝損傷具有更強的抗炎和抗纖維化作用。
益生菌在加工、儲存和胃腸道條件下面臨著嚴峻的挑戰(zhàn)。具有pH響應性的多糖基微凝膠可以保護益生菌免受刺激性胃酸的侵害，并以可行的形式在腸道中響應性地釋放它們。多糖水凝膠是半固體且機械強度較弱。通常需要額外的交聯，例如二硫鍵來固化水凝膠。然而將益生菌封裝在機械強度較高的載體系統內非常重要。如果壁材多糖同時能夠被腸道菌群用作益生元，那就更有利了。
在這項研究中，我們開發(fā)了一種具有腸道反應性和粘膜粘附特性的鐵離子交聯MCP微凝膠，并通過自然結合的棕色生物活性物質的酚醛金屬骨架進行機械強化。這些微凝膠在酸性條件下具有完整的結構，并且僅在pH中性條件下破裂，可以響應地釋放具有高粘膜粘附和定殖的高活性益生菌。棕色生物活性物質通過疏水相互作用和氫鍵與多糖（MCPC）天然結合，并表現出出色的抗炎和抗氧化特性。這些棕色生物活性物質是精確的益生元，可以特異性提高體內阿克曼氏菌屬的豐度。然后，將益生菌Akkermansia muciniphila(AKK)裝入棕色生物活性框架強化微凝膠中。與游離AKK和巴氏滅菌AKK相比，MCPC成分和負載AKK之間具有更強的協同健康益處。
MCPC微凝膠可以專門向腸道輸送高活性AKK，從而調節(jié)微生物群平衡并保護腸道屏障。MCPC微凝膠還將抗氧化棕色生物活性物質專門輸送到肝臟中，以減輕肝臟氧化應激和炎癥。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應用
將初始益生菌密度為10 6 CFU mL?1的MCPC/NZ9000在MRS培養(yǎng)基（pH 5.5）中培養(yǎng)，使用CLSM監(jiān)測益生菌的生長。通過Bioscreen C自動生長曲線分析儀在OD 600 nm處監(jiān)測MCPC/WCFS1的生長。每1小時獲取OD 600值，共80小時。
實驗結果
成功制備了機械強度高的MCPC微凝膠，該微凝膠通過酚類金屬配位框架穩(wěn)定，用于益生菌和多酚的共同遞送。該微凝膠具有增強的益生菌胃酸保護、腸道響應釋放和粘膜粘附特性的組合。棕色生物活性物質天然結合在MCP多糖上，事實證明，MCP多糖是提高阿克曼氏菌豐度的精確益生元。MCPC/AKK通過依次在腸道中提供活性AKK并在肝臟中提供棕色抗氧化劑，有效改善APAP誘導的肝損傷。MCPC微凝膠在腸道中的高活性AKK可以恢復腸道微生物失調并促進SCFA產生，從而增強肝功能，調節(jié)氧化應激和炎癥，并通過腸肝軸修復腸道屏障。
圖1、酚醛金屬配位框架穩(wěn)定的涼粉草多糖復合物(MCPC)微凝膠，用于控制釋放對乙酰氨基酚(APAP)誘導的肝損傷。采用MCP和棕色生物活性物質組成的MCPC，通過離子配位制備微凝膠。微凝膠內的棕色生物活性物質-Fe 3+酚醛金屬骨架為微凝膠提供了機械結構支撐。MCPC微凝膠表現出胃酸耐受性，有利于益生菌保護，并根據腸道pH值釋放益生菌。這有助于益生菌粘附、保留和定植于腸道。當微凝膠解離時，棕色生物活性物質依次釋放，吸附的半乳糖片段通過肝細胞半乳糖受體的識別，促進生物活性物質進入肝臟。腸道中釋放的益生菌和肝臟中的棕色生物活性物質的協同作用有助于減輕APAP引起的小鼠肝損傷。
圖2、MCPC和MCP微凝膠的制備和表征。A)MCPC微凝膠的SEM。B)用羅丹明B染色的MCPC微凝膠的光學顯微鏡圖像。C)MCP和MCPC微凝膠的SEM和TEM。D)MCPC微凝膠的元素圖譜。E)MCPC、MCP及其微凝膠的z-電位。F)MCP微凝膠的穆斯堡爾譜。G)MCPC和MCP微凝膠的FT-IR光譜。H)納米壓痕力-距離曲線，I)MCPC和MCP微凝膠的楊氏模量。
圖3、評估MCPC、MCP和棕色生物活性物質的體外抗氧化、抗炎和細胞毒性特性。A)總抗氧化能力(T-AOC)，B)DPPH自由基，C)MCPC、MCP和棕色生物活性物質的羥基自由基清除能力。D)MCPC、MCP和棕色生物活性物質的細胞抗氧化活性。使用MCPC、MCP和棕色生物活性物質進行酶聯免疫吸附測定(ELISA)，以檢查E)IL-1β和F)IL-10的水平。原始246.7細胞用MCPC、MCP和棕色生物活性物質(200μg mL?1)預處理24小時。G)MCPC對Caco-2細胞的細胞毒性評估。
圖4、pH響應型MCPC微凝膠可實現腸道響應性釋放并增強益生菌的活力。A)CLSM和B)加載NZ9000（紅色）的MCPC微凝膠的SEM圖像。C)CLSM圖像顯示NZ9000在M17肉湯（pH 5.5）中的微凝膠中生長。D)微凝膠對各種益生菌的包封效率。E)Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測試MRS肉湯中游離WCFS1和MCPC/WCFS1的生長曲線(80h)。F)MCPC/NZ9000微凝膠在SGIF中處理前后的熒光圖像。G)活細胞（綠色）/死細胞（紅色）活力，H)存活計數，I)Bioscreen C全自動生長曲線分析儀測試游離WCFS1和MCPC/WCFS1在SGF處理前和處理30分鐘后的對應的生長曲線((80h))。
圖5、通過與MCPC介導的相互作用增強腸道粘膜粘附和益生菌定植。A)粘膜粘附曲線，B)MCPC和MCP對大鼠腸粘膜的最大分離力(MSF)和總粘附功(TAW)。C)MCPC濃度對粘液粘附益生菌影響的菌落計數。D)粘液（用綠色Alexa Fluor 488-WGA標記）滲透無紅色和嵌入NZ9000的CLSM 3D圖像。E)FITC標記的游離WCFS1或MCPC/WCFS1在胃腸道中的滯留。F)紅色游離NZ9000或MCPC/NZ9000在腸粘液中的分布。空腸粘液用綠色Alexa Fluor 488-WGA染色，腸絨毛細胞核用藍色DAPI染色。G)小鼠糞便中各種AKK的菌落計數。
總結
口服益生菌在加工、儲存和胃腸道惡劣條件下面臨挑戰(zhàn)?；诙嗵堑乃z遞送系統在益生菌保護方面很有前景，但其半固體且強度較弱，并且往往需要額外的交聯來固化其結構。研究人員開發(fā)了一種具有腸道反應性和粘膜粘附特性的鐵離子交聯MCPC微凝膠。首先將MCPC分離為MCP和棕色生物活性物質，并研究了它們的化學成分。然后比較了Fe3+交聯MCPC和MCP微凝膠的理化性能，尤其是機械強度。研究了負載益生菌的MCPC微凝膠的胃酸耐受性、腸道pH響應性和粘附保留特性。微凝膠成分的益生元作用也在體內進行了評估。最后，研究了其對急性肝損傷小鼠模型的緩解作用，重點關注氧化應激、炎癥和腸道菌群調節(jié)。這項研究為應用MCPC微凝膠益生菌遞送系統通過腸-肝軸緩解肝臟疾病提供了靈感，提供了一個強大的基于天然多糖的微凝膠平臺，用于通過腸肝軸控制釋放和靶向輸送具有健康潛力的益生菌。
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