摘要
生物素蛋白連接酶（BPL）廣泛存在于生命的三個域中。范式BPL是大腸桿菌BirA蛋白，它還作為生物素生物合成途徑的阻遏蛋白。本文報告乳酸乳球菌擁有兩個不同的birA直系同源物（birA1_LL和birA2_LL）。與大腸桿菌的情況不同，乳酸乳球菌似乎是生物素營養(yǎng)缺陷型，因為它缺乏完整的生物素生物合成途徑。相反，它保留了兩個生物素轉運蛋白編碼基因（bioY1_LL和bioY2_LL），表明其采用清除策略從環(huán)境中獲取生物素。通過兩個乳酸乳球菌birA基因補充條件致死性大腸桿菌birA突變體的能力，判斷了它們的體內功能。薄層色譜和質譜分析表明，這兩種重組BirA蛋白通過預期的生物素酰-AMP中間體，催化受體生物素羧基載體蛋白（BCCP）的生物素化反應。凝膠遷移實驗用于表征bioY1_LL和BirA1_LL。我們還測定了乳酸乳球菌攝取3H-生物素的能力?？傊?，我們的結果解讀了益生菌細菌乳酸乳球菌中存在的具有冗余基因的獨特生物素清除途徑。
生物素（維生素H）對生命三個域至關重要。生物素是中心代謝中共價結合的酶輔因子，例如形成脂肪酸構建塊丙二酰-CoA所需的乙酰-CoA羧化酶（ACC）反應1。大多數(shù)細菌合成生物素。然而，一些細菌必須從環(huán)境中清除生物素。BioY是許多細菌中發(fā)現(xiàn)的生物素轉運蛋白。通常，BioY被認為是能量耦合因子轉運家族（ECF）的底物結合組分（S組分），ECF是一種參與多種微量營養(yǎng)素攝取的ATP結合盒轉運蛋白。大腸桿菌既可以合成生物素，也可以使用非BioY/ECF機制轉運生物素?。有趣的是，豬鏈球菌（一種動物病原體）中生物素的獲取完全依賴于BioY轉運蛋白的存在，因為它缺乏生物素合成途徑?。Hebbeln及其同事報道了α-變形菌門紅桿菌中三聯(lián)生物素轉運蛋白BioMNY的體外生物化學2。盡管乳酸乳球菌BioY膜蛋白的晶體結構已被報道?，但bioY的調控表達和BirA守門蛋白介導的生物素感知仍未知。
乳酸乳球菌IL1403是低GC革蘭氏陽性細菌組的成員。通常認為它在植物上休眠，但在胃腸道內生長。鑒于乳酸乳球菌在牛奶中劇烈發(fā)酵乳糖，產(chǎn)生ATP和乳酸，它已被廣泛應用于乳制品行業(yè)，如酪乳和奶酪生產(chǎn)。由于其在食品發(fā)酵中的長期作用，乳酸乳球菌被普遍認為是安全的（GRAS）狀態(tài)。乳酸乳球菌存在于動物和人類腸道中，顯著有益于免疫系統(tǒng)，通常被視為益生菌。令人意外的是，乳酸乳球菌IL1403具有小基因組（2.37 Mb），估計僅為大腸桿菌基因組（MG1655為4.64 Mb）的一半，卻在脂質代謝以及生物素利用途徑中編碼許多冗余（和/或重復）基因座。雖然出乎意料，但這種安排并非沒有先例，因為在副球菌屬中觀察到類似情況。這種在乳酸乳球菌最小基因組中存在生物素代謝冗余基因的罕見情況可能提供一些未知的生理優(yōu)勢，提出了一種可能性：它代表了細菌進化及其環(huán)境生態(tài)位選擇的遺跡。
本文中，我們對生物素代謝背景下的冗余基因進行了系統(tǒng)功能分析。我們證明了乳酸乳球菌生物素轉運的體內證據(jù)，并確定了兩個BirA直系同源物的不同功能分配。最后，我們formulated了乳酸乳球菌生物素清除的工作模型（圖1）。兩種不同生物素蛋白連接酶的非典型出現(xiàn)可能表明其適應生長環(huán)境和/或生態(tài)位的獨特進化歷史。
圖1.當前關于生物素吸收及BirA蛋白生物素連接酶/阻遏物功能的模型。(A)乳酸乳球菌中生物素吸收與利用的假說通路，展示了BirA介導的BCCP生物素化反應的兩個半反應。(B)大腸桿菌BirA抑制生物素合成通路。(C)梅里蒂斯芽孢桿菌BioR抑制生物素合成通路及生物素轉運系統(tǒng)的表達。(D)豬鏈球菌BirA對bioY基因的轉錄抑制作用。(E)乳酸乳球菌BirA1抑制bioY基因的表達。
方法
細菌菌株和生長條件
使用的大腸桿菌菌株包括MG1655、BM4092（birA的Km突變體）、DH5α和BL21(DE3)。使用乳酸乳球菌IL1403°和豬鏈球菌2菌株進行功能分析。使用Luria Bertani（LB）和豐富肉湯（RB）培養(yǎng)大腸桿菌，使用Todd Hewitt Broth（THB）和基本培養(yǎng)基維護乳酸乳球菌IL1403和豬鏈球菌2。必要時添加抗生素（單位mg/升）：氨芐鈉，100；硫酸卡那霉素，50。
質粒和遺傳操作
通過PCR擴增兩個birA基因（birA1[L0191]和birA2[L0192]），并克隆到表達載體pET28(a)中以創(chuàng)建用于親和純化的組氨酸標簽蛋白，以及克隆到阿拉伯糖誘導載體pBAD24中用于基因互補實驗，如先前所述。將pET28衍生物導入BL21(DE3)進行蛋白質生產(chǎn)，而表達birA的pBAD24衍生物轉化到birA的Km突變體（BM4092）中進行birA功能測定。所有獲得的質粒通過PCR和DNA測序驗證。
蛋白質純化
如先前所述進行截短AccB（AccB87）apo受體蛋白的表達、純化和定量。從1升LB培養(yǎng)物中純化重組BirA1_LL和BirA2_LL蛋白，培養(yǎng)物在37°C生長至OD600為0.8，通過添加0.5 mM IPTG在30°C誘導蛋白質生產(chǎn)4小時。使用先前描述的方案2?進行細胞裂解和蛋白質純化。純化的蛋白質在儲存緩沖液（含50 mM Tris-HCl[pH 8.0]、150 mM KCl、10%甘油和0.1 mM DTT）中透析過夜，使用Millipore濃縮器濃縮，閃凍，并儲存在-80°C。所有蛋白質樣品的純度通過12%SDS-PAGE凝膠分離和考馬斯亮藍染色判斷。
液相色譜
使用Waters Q-Tof API-US Quad-ToF質譜儀測定兩個乳酸乳球菌BirA直系同源物（BirA1_LL和BirA2_LL）。從凝膠中切取目標蛋白條帶，用胰蛋白酶（G-Biosciences St.Louis,MO）消化。最后，將所得肽段上樣到Waters Atlantis C-18柱（0.03 mm顆粒，0.075 mm x 150 mm），獲取的數(shù)據(jù)用于通過ms/ms進行進一步分析。
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