溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)屬于弧菌科(Vibrionaceae)弧菌屬(Vibrio)，為革蘭氏陰性短桿菌，無莢膜和芽孢，是廣泛存在于海水中的一種條件致病菌。它不僅對于魚、蝦、貝有致病性，同時對于人類也有一定的致病性，能夠引起腹瀉和食物中毒。而對于溶藻弧菌的防治，養(yǎng)殖戶通常使用傳統(tǒng)的抗生素或者消毒劑，但抗生素的濫用會導致養(yǎng)殖過程中溶藻弧菌產(chǎn)生耐藥性，不僅影響用藥效果，同時耐藥菌還會隨著食物鏈的傳播感染人類，危害人類生命安全。另一方面，隨著人們生活水平的不斷提高，大眾在食品的選擇上對綠色理念越發(fā)的重視。因此，亟需尋找一種新的既環(huán)保、友好又能有效控制水產(chǎn)養(yǎng)殖動物溶藻弧菌病的方法。
噬菌體作為一種微生物病毒，能夠侵染并裂解細菌、螺旋體、放線菌等。早在20世紀初期，噬菌體就被認為有替代抗生素的巨大潛力。相比于抗生素的高效，有關(guān)噬菌體療法的研究始終落后于抗生素的研究。但隨著近年來細菌耐藥性問題趨向嚴峻，研究者重新將目光投向噬菌體，期望能夠開發(fā)出高效的噬菌體制劑。2009年，Wright等首次在感染多重耐藥銅綠假單胞菌的慢性耳炎患者身上使用噬菌體治療方案，經(jīng)過治療后，患者的癥狀均得到改善，并且沒有產(chǎn)生毒副作用。Cao等從臨床患者體內(nèi)分離得到一株多重耐藥性肺炎克雷伯菌，并用其感染小鼠，隨后使用噬菌體進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)未使用噬菌體治療的小鼠在24 h內(nèi)全部死亡，而使用噬菌體治療的小鼠存活率則高出許多。此外，噬菌體在弧菌病防治方面的研究也取得了一些成果。Stalin等研究發(fā)現(xiàn)，在斑節(jié)對蝦幼體感染哈維氏弧菌后，使用噬菌體能夠有效提高幼體的存活率。胡蝶等將副溶血弧菌制成噬菌體微膠囊，并拌于飼料中投喂方斑東風螺和南美白對蝦，發(fā)現(xiàn)實驗生物的腸道和水體中的宿主菌都有大幅度的減少。于鴿從自然水體中分離得到一株溶藻弧菌噬菌體，并將其用于南美白對蝦的攻毒實驗，結(jié)果表明108pfu/mL的噬菌體溶液的保護率達88.20%。Sasikala等分離得到的一株溶藻弧菌噬菌體能夠有效抑制溶藻弧菌的生物膜形成，并且在數(shù)個小時后還對溶藻弧菌有殺滅作用。
本文以溶藻弧菌V039為宿主，分離得到一株新型溶藻弧菌噬菌體φV039C，并對其進行了電鏡形態(tài)觀察、最佳感染復數(shù)、一步生長曲線等生物學特性的研究，以及全基因測序、序列分析和功能預測，以期更好地了解其裂解機制，為溶藻弧菌的噬菌體治療提供依據(jù)。
1、材料與方法
1.1材料
宿主菌：病原菌(溶藻弧菌V039)從福建漳浦的對蝦養(yǎng)殖場中分離得到，并由本實驗室保藏。
主要試劑和儀器：LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂(NA)、瓊脂粉、SM病毒提取緩沖液均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；DL15000、DL2000、DNase I、RNase A和限制性內(nèi)切酶(EcoR I、EcoR V、BamH I、HindⅢ)均為日本TaKaRa公司產(chǎn)品；TIANamp病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；透射電子顯微鏡(TEM)為美國FEI公司制造產(chǎn)品；離心機(Eppendorf 5427R)為德國艾本德公司產(chǎn)品。
1.2方法
1.2.1噬菌體的分離
將取自福建漳浦各對蝦養(yǎng)殖場的水樣混合于潔凈的水桶中，再把培養(yǎng)至對數(shù)期的溶藻弧菌V039菌液倒入水樣中，混勻后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中24 h，以富集潛在噬菌體。之后，取5 mL富集液10 000 r/min離心3 min，上清液用0.22μm濾膜過濾備用。吸取100μL V039菌液均勻涂布在營養(yǎng)瓊脂(添加體積分數(shù)為2%的NaCl)上，吸取10μL富集液分數(shù)滴點于平板上，晾干后置于30℃培養(yǎng)，24 h后觀察點接處是否有空斑出現(xiàn)，如有空斑即作為溶藻弧菌V039的噬菌體進行挖斑純化。
1.2.2噬菌體的純化與效價測定
采用雙層平板法進行純化和效價測定。將噬菌體形成的空斑挖到SM緩沖液中，4℃過夜。用無菌生理鹽水將浸提液稀釋到合適梯度，吸取100μL稀釋液和100μL宿主菌液至6 mL半固體(含質(zhì)量分數(shù)為0.65%的瓊脂)LB肉湯(提前置于50℃保溫)中混合均勻，傾倒在營養(yǎng)瓊脂(添加體積分數(shù)為2%的NaCl)上，凝固后30℃培養(yǎng)16 h。挑取單個噬菌斑至SM緩沖液中4℃過夜，重復上述操作對分離得到的噬菌體純化3～5次。噬菌體效價(TT)指的是每毫升樣品中含有的具有侵染性的噬菌體顆粒數(shù)，又稱噬菌斑形成單位數(shù)(plaque-forming unit)。檢測樣品梯度稀釋后做雙層平板法培養(yǎng)，每個梯度設(shè)3個平行，取噬菌斑顆粒數(shù)在30～300 pfu之間為有效數(shù)據(jù)，以平均數(shù)計算噬菌體密度。
1.2.3噬菌體電鏡觀察
取噬菌體增殖液20μL(>1010pfu/mL)滴到銅網(wǎng)上吸附30 min，用2%(體積分數(shù))磷鎢酸(PTA)負染10 min，室溫干燥后，用透射電子顯微鏡觀察并拍攝噬菌體的形態(tài)，同時測量頭部直徑等數(shù)據(jù)。
1.2.4噬菌體基因組的提取和酶切分析
取噬菌體增殖液(≥1010pfu/mL)至無菌EP管中，分別加入DNase I與RNase A于37℃反應1 h，以去除噬菌體增殖液中游離的宿主菌DNA/RNA，80℃處理15 min使酶失活。之后，利用TIANamp病毒基因組DNA/RNA試劑盒提取噬菌體基因組。
酶切反應體系為10μL。分別取噬菌體基因組8μL于6個無菌PCR管中，再分別加入1μL的酶(DNase I、RNase A、EcoR I、EcoR V、BamH I、Hind III)以及1μL的10×Loading Buffer，于37℃反應1 h。將酶切產(chǎn)物置于1%(質(zhì)量分數(shù))瓊脂糖凝膠中電泳(110 V)24 min，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。
1.2.5噬菌體最佳感染復數(shù)測定
感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)，指的是噬菌體在感染開始時噬菌體與宿主菌的比值。測定方法：培養(yǎng)宿主菌液至生長對數(shù)期，按MOI值為1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01各吸取50μL的噬菌體液和宿主菌液到900μL無菌LB肉湯中，30℃、160 r/min培養(yǎng)8 h，10 000 r/min離心2 min，用0.22μm濾膜過濾，測定噬菌體效價。效價最高的感染復數(shù)即為最佳感染復數(shù)。
1.2.6噬菌體一步生長曲線測定
按照感染復數(shù)為0.1的比例，混合噬菌體液和宿主菌液，宿主菌液濃度為1×108cfu/mL，總體積為1 mL，30℃孵育10 min，讓噬菌體充分吸附在宿主菌上，10 000 r/min離心2 min，棄上清液，用LB肉湯洗滌2次去除未吸附的噬菌體，加入1 mL LB肉湯重懸。置于30℃的恒溫培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，并開始計時，分別在0、10、20、30、40、50、60 min時間點取樣，測定噬菌體效價并繪制生長曲線。
1.2.7噬菌體的全基因組測序及生物信息學分析
噬菌體φV039C的基因組利用第三代單分子測序平臺(PacBio SMRT)進行全基因組測序分析。利用GeneMarkS(http://topaz.gatech.edu/GeneMark/)網(wǎng)站進行基因預測。使用在線blastp工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)進一步對預測的基因進行注釋。使用軟件DNA Plotter繪制全基因組圈圖。用MEGA 7.0軟件，選擇N-乙酰壁氨酰-L-丙氨酸酰胺酶(ORF6)和大亞基終止酶(ORF19)兩種蛋白進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。
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