針對(duì)酒曲中的微生物進(jìn)行分離純化，得到11株細(xì)菌和2株真菌，并采用酪蛋白平板法和Arima時(shí)間法篩選出了1株產(chǎn)凝乳酶的細(xì)菌菌株編號(hào)為L(zhǎng)B-51。通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實(shí)驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌，將該產(chǎn)凝乳酶菌株命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1。該菌株在液體LB培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力為（431.53±15.89）SU/mL，蛋白水解活力為（5.05±0.59）U/mL，所產(chǎn)凝乳酶凝乳活力高而蛋白水解活力低，凝乳酶粗酶單位酶活力為1.54×105SU/g。解淀粉芽孢桿菌GSBa-1是分離篩選自酒曲中的一株高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌，因此其來(lái)源安全，可作為工業(yè)化候選菌株進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)。
凝乳酶（EC 3.4.23.4）是干酪加工時(shí)添加于原料乳中使乳液凝固的關(guān)鍵性酶，其凝乳及蛋白水解活性對(duì)干酪的得率、質(zhì)構(gòu)和特殊風(fēng)味有著非常重要的影響；傳統(tǒng)凝乳酶的制作是用鹽從牛犢皺胃中浸提出來(lái)。隨著世界干酪產(chǎn)量逐年上升，傳統(tǒng)凝乳酶的供應(yīng)已無(wú)法滿足現(xiàn)代干酪工業(yè)生產(chǎn)的需求。為此，國(guó)內(nèi)外科學(xué)家們進(jìn)行了大量的研究以尋找凝乳酶新的來(lái)源。微生物具有生長(zhǎng)不受氣候和地域的限制，來(lái)源廣泛且發(fā)酵容易控制，生長(zhǎng)周期短、產(chǎn)酶量大、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)勢(shì)，是目前最有發(fā)展?jié)摿Φ拿钢苿﹣?lái)源。目前微生物源凝乳酶的研究主要集中在真菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶方面，工業(yè)上主要采用米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等真菌發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶；而細(xì)菌具有較真菌體積小、繁殖快、產(chǎn)物易于提取分離、適合高密度培養(yǎng)增殖產(chǎn)酶等優(yōu)勢(shì)，因此利用細(xì)菌工業(yè)化發(fā)酵制備凝乳酶是近年來(lái)凝乳酶研究開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)問(wèn)題。
江米酒是我國(guó)一種傳統(tǒng)食品，由酒曲發(fā)酵江米制作而成。而宮廷奶酪是由江米酒凝固牛乳制作而成，口感細(xì)膩，具有良好的乳膠體穩(wěn)定性。其凝乳過(guò)程主要與江米酒中的凝乳酶有關(guān)；該酶是發(fā)酵劑酒曲中的微生物發(fā)酵江米代謝的產(chǎn)物。目前，研究者主要從酒曲中篩選得到產(chǎn)凝乳酶的霉菌，并進(jìn)行了相關(guān)的研究。酒曲中的重要菌系——細(xì)菌，也屬于酒曲中的正常菌相；但國(guó)內(nèi)尚鮮有從酒曲中篩選高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌的相關(guān)報(bào)道。江米酒作為一種傳統(tǒng)食品，采用其中篩選得到的菌株發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶，在食品衛(wèi)生學(xué)上是安全的。
本研究擬從江米酒中篩選高產(chǎn)凝乳酶細(xì)菌，對(duì)其形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列分析進(jìn)行鑒定，并對(duì)其產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力及蛋白水解活力進(jìn)行測(cè)定。該研究拓寬了微生物源凝乳酶產(chǎn)生菌的菌源，為進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)食用安全的干酪加工用細(xì)菌凝乳酶提供了理論支持。
1材料與方法
1.1材料與培養(yǎng)基
酒曲產(chǎn)自江蘇蘇州；長(zhǎng)江米購(gòu)于北京市永輝超市；脫脂乳粉產(chǎn)自澳大利亞。
LB液體培養(yǎng)基：酵母提取物5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L，121℃高壓滅菌20 min。LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂粉。yEPD培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂粉15 g/L，pH 6.0，115℃濕熱滅菌20 min。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯浸粉15 g/L、葡萄糖3 g/L、瓊脂粉15 g/L、蒸餾水1L，121℃高壓滅菌20 min。酪蛋白培養(yǎng)基：蛋白胨0.25%、葡萄糖1%、酵母膏0.1%、干酪素1%、瓊脂2%、脫脂牛乳5%，pH7.0，95℃滅菌15 min。
1.2儀器與設(shè)備
HWS 12恒溫水浴加熱鍋上海一恒科學(xué)實(shí)驗(yàn)裝備有限公司；HZQ-Q氣浴恒溫?fù)u床哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司；高速離心機(jī)CR21GⅢ、U-3900分光光度計(jì)日本日立有限公司；全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)Bio-Rad公司。
1.3方法
1.3.1江米酒的制備
按5%的酒曲添加量接種于提前蒸熟冷卻好的長(zhǎng)江米中，接著把經(jīng)滅菌冷卻好的去離子水按40%添加到江米中，攪拌均勻，30℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)3 d。
1.3.2江米酒中微生物的分離純化
采用梯度稀釋法將江米酒倍比稀釋，分別取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀釋液各50μL涂布于LB、yEPD和PDA 3種固體培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，并于第2、3、5天挑取不同菌落進(jìn)一步劃線純化，直至純種，分別將其編號(hào)以作進(jìn)一步研究。
1.3.3產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌的確定
酪蛋白法初篩產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株：將達(dá)到純種的菌株分別以三點(diǎn)法接于酪蛋白平板上，放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，觀察不同菌株產(chǎn)白色凝乳圈的大小和水解圈的大小。
不同培養(yǎng)基發(fā)酵復(fù)篩菌株：在產(chǎn)生凝乳圈和水解圈的菌株中，分別從平板中挑取少量菌落接種于LB、yEPD和PDA 3種不同液體培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)24 h作為活化種子液，然后按3%的接種量接于已滅菌的不同培養(yǎng)基中，30℃、120 r/min搖床振蕩培養(yǎng)后測(cè)定凝乳活力和蛋白水解活力。
1.3.4凝乳活力的測(cè)定
酶活力根據(jù)改進(jìn)的El-Bendary等的方法測(cè)定，將脫脂乳粉溶于0.01 mol/L的CaCl2溶液配制成10%的脫脂乳溶液，室溫放置30 min；于35℃中保溫5 min，35℃條件下，準(zhǔn)確量取待測(cè)酶液0.2 mL加入2 mL10%的脫脂乳溶液中，迅速混勻，開(kāi)始計(jì)時(shí)，準(zhǔn)確記錄至絮狀凝集顆粒出現(xiàn)為止。凝乳活力的定義：在40 min內(nèi)凝固100 g/L的脫脂乳1 mL所要的凝乳酶量規(guī)定是一個(gè)索氏單位（Soxhelt unit，SU），按公式（1）計(jì)算：
式中：t為凝乳時(shí)間/s；n為酶液稀釋倍數(shù)。
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