2.3優(yōu)勢乳酸菌的篩選與生理生化特征的鑒定
根據(jù)肉制品發(fā)酵劑的篩選標準進行產(chǎn)黏性試驗、耐鹽性試驗、耐亞硝酸鹽試驗、耐酸性試驗、葡萄糖產(chǎn)氣試驗、產(chǎn)H2O2試驗、產(chǎn)H2S試驗、石蕊牛奶酸凝試驗、產(chǎn)氨試驗、硝酸鹽還原試驗、M.R試驗、V.P試驗、明膠液化試驗、淀粉水解試驗、耐高低溫試驗(15℃、45℃)、運動性試驗、糖醇發(fā)酵試驗。
2.4菌株的生長曲線和產(chǎn)酸能力試驗
將鑒定出的菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。每4 h測1次。用可見光分光光度計于640 nm下，測定菌液的吸光度值。pH值用pH計測定。
2.5菌株的耐溫性試驗
不同菌株接種于其液體培養(yǎng)基中，分別置于15，20，25，30，35，40，45℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以不接種的液體培養(yǎng)基為空白對照，在640 nm條件下測底OD值。
2.6 16S rDNA序列分析
2.6.1菌株DNA的提取
將篩選出菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，采用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株的基因組DNA，并采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
2.6.2 16S rDNA基因序列PCR擴增及序列分析
16S rDNA擴增引物:應(yīng)用細菌通用引物，正向引物27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’;反向引物1942R:5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。
PCR擴增反應(yīng)體系(50μL):正向引物27F和反向引物1942R各1.5μL，dNTP(10 mmol/L)1.0μL，10×Buffer(2.5 mmol/L Mg2+)5.0μL，ddH2O 39.0μL，基因組DNA 1.0μL，Taq聚合酶(5 u/μL)1.0μL。
PCR陰性對照基因組DNA采用超純無菌水代替。
PCR擴增反應(yīng)程序:95℃預變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，經(jīng)45次循環(huán)，72℃終延伸7 min。
PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送交北京擎科新業(yè)生物公司進行測序，測得的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫已知序列進行比對及同源性分析，應(yīng)用MEGA5.0軟件的鄰位相連(Neighbor-joining)法分析所測序列與GenBank中模式菌株16S rDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。
3結(jié)果與分析
3.1菌株形態(tài)學鑒定結(jié)果
采用MRS固體培養(yǎng)基，從臭鱖魚中分離出50株菌株，觀察菌落溶鈣圈、革蘭氏染色及過氧化氫酶試驗結(jié)果，得到能產(chǎn)生溶鈣圈、革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶呈陰性的疑似乳酸菌11株，具體特征見表1。
表1菌株形態(tài)學鑒定結(jié)果
根據(jù)表1的鑒定結(jié)果，所有的菌株都是呈乳白色、且菌落隆起表面光滑。分離純化得到的所有11株疑似乳酸菌有短桿狀、球狀，排列方式也不盡相同。
3.2優(yōu)勢乳酸菌的篩選與生理生化特征的鑒定
將分離純化得到的11株進行生理生化特征的鑒定試驗，結(jié)果如表2所示。
根據(jù)表2的生理生化鑒定結(jié)果，分離所獲得菌株11株菌中，只有L4、L12、L20、L36符合肉制品發(fā)酵菌株指標的要求:不產(chǎn)黏液、能耐受6 g/dL NaCl;在pH 4.5和250 mg/dL NaNO2條件下正常生長;發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣;水解精氨酸不產(chǎn)氨;有良好的硝酸鹽還原能力;M.R反應(yīng)陽性;V.P反應(yīng)陰性;不能發(fā)生明膠液化反應(yīng);能水解淀粉;可在15℃和45℃下生長。
將篩選得到的4株菌株進行糖醇發(fā)酵試驗，具體結(jié)果見表3。
根據(jù)4株菌的表型特征和生理生化特點，檢索《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)、《常見細菌鑒定手冊》，可以初步判斷L4為屎腸球菌(Enterococcus faecium)、L12為彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus)、L20為堅強腸球菌(Enterococcus durans)、L36為干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)。
表2生理生化鑒定結(jié)果
表3糖醇發(fā)酵試驗結(jié)果
3.3菌株生長曲線
將篩選得到的4株優(yōu)良乳酸菌接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分析生長情況，見圖1。
圖1乳酸菌生長曲線
如圖1所示，L4在4～8 h生長速度明顯高于其他菌株，在8～12 h時左右達到菌體密度最大值，之后進入穩(wěn)定生長期，Herranz等人發(fā)現(xiàn)1株腸球菌在12 h時達到菌株密度最大值，與之相符。其他菌株在培養(yǎng)到8～16 h生長速度明顯加快，培養(yǎng)到16 h后進入到穩(wěn)定生長期。從圖1可以看出，篩選得出的4株菌均具備較強的生長能力。
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