1.3.3 PMEC生長(zhǎng)曲線的繪制
采用CCK-8法進(jìn)行PMEC生長(zhǎng)曲線的繪制。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第9代PMEC常規(guī)消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以1×104個(gè)/mL的濃度接種到96孔板中，共分為6個(gè)組，每組5個(gè)重復(fù)，每孔中加入100μL完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于接種后1、3、5、7、8 d加入10μL CCK-8試劑，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(OD)值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制PMEC的生長(zhǎng)曲線。
1.3.4 IFA檢測(cè)ZO-1蛋白分布
免疫熒光檢測(cè)PMEC之間ZO-1蛋白的分布，具體步驟:將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第9代PMEC常規(guī)消化后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以3×105個(gè)/mL的濃度接種到Transwell小室的上室中，并加入200μL完全培養(yǎng)基，下室中加入800μL完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)6~8 d后，使用手術(shù)刀片和眼科鑷將小室中的聚碳酸酯膜撕下并貼于載玻片上，隨后將載玻片上的聚碳酸酯膜用免疫組化筆圈出并滴加無(wú)水甲醇于-20℃固定10 min，200μL PBS洗滌3次后，滴加200μL 2%牛血清白蛋白(BSA)-PBS溶液于37℃恒溫培養(yǎng)箱封閉1 h，進(jìn)一步滴加200μL(用1%的BSA-PBS溶液稀釋)ZO-1抗體(1∶100)，4℃孵育過(guò)夜;洗去一抗并在圈內(nèi)的膜中滴加200μL(用1%的BSA-PBS溶液稀釋)AF594山羊抗兔IgG(1∶200)，室溫孵育45 min后，200μL PBS洗滌3次;加入100μL(用1%的BSA-PBS溶液稀釋)核染液Bisbenzimde(1∶2 000)，室溫避光顯色10 min，200μL PBS洗滌3次后拍照。
1.3.5催乳素刺激PMEC
將消化下來(lái)的PMEC進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，分為對(duì)照組及0.2 mg/L和2 mg/L催乳素刺激組，將細(xì)胞接種在12孔板上，每組3個(gè)重復(fù)孔，每孔加1 mL含10%FBS、2%抗生素溶液、50 mg/L慶大霉素、5 mg/L牛胰島素、5 mg/L氫化可的松的DMEM營(yíng)養(yǎng)液(不含EGF)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，當(dāng)每孔細(xì)胞達(dá)到70%聚集時(shí)，對(duì)各孔細(xì)胞進(jìn)行換液，對(duì)照組的營(yíng)養(yǎng)液與原營(yíng)養(yǎng)液相同，催乳素刺激組的營(yíng)養(yǎng)液為1 mL含10%FBS、2%抗生素溶液、50 mg/L慶大霉素、5 mg/L牛胰島素、5 mg/L氫化可的松、0.2 mg/L或2 mg/L催乳素的DMEM溶液(不含EGF)。最后培養(yǎng)3 d，每天換一次營(yíng)養(yǎng)液。72 h后收樣，加入TRIzol或細(xì)胞裂解液提取核酸或蛋白。
1.3.6 IFA鑒定CK-18表達(dá)
將PMEC均勻鋪在96孔板上，分為陰性對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組8個(gè)重復(fù)，驗(yàn)證PMEC中CK-18的表達(dá)，待孔中細(xì)胞長(zhǎng)到90%聚集時(shí)，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，常溫PBS洗滌細(xì)胞2次并棄去。每孔加入預(yù)冷的無(wú)水甲醇，-20℃固定10 min，200μL PBS洗滌3次，棄去后每孔加入100μL的2%BSA-PBS封閉液于37℃，封閉1 h。棄去每孔液體，試驗(yàn)組每孔加入100μL(用1%的BSA-PBS溶液稀釋)CK-18抗體(1∶200);對(duì)照組每孔加入100μL 1%BSA-PBS稀釋液，37℃孵育1 h。200μL PBS洗滌3次后，每孔加入100μL(用1%的BSA-PBS溶液稀釋)由YF488標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶200)，于37℃孵育45 min。200μL PBS洗滌3次后，每孔加入50μL(用1%的BSA-PBS溶液稀釋)核染液Bisbenzimde(1∶2 000)，室溫避光顯色10 min，200μL PBS洗滌3次后，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.7 RT-PCR檢測(cè)CNS2基因的轉(zhuǎn)錄
使用TRIzol總RNA提取試劑從豬乳汁和PMEC中提取總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用PCR檢測(cè)CNS2基因(GenBank登錄號(hào):GU827390.1)的表達(dá)。引物序列:F:5′-ATTGTTCCCAAGCGTAA-3′，R:5′-GAGACTGGAGCAGAGGC-3′。PCR體系(20μL):10μL 2×Es Taq MasterMix(Dye)，7μL ddH2 O，25μmol/L上下游引物各0.5μL，2μL cDNA(100 ng/μL)。反應(yīng)程序:94℃3 min預(yù)變性;94℃30 s變性，46℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán);72℃10 min。
1.3.8 Western blot鑒定CNS2蛋白的表達(dá)
將PMEC均勻鋪在12孔板，分別用0.2μg/mL和2μg/mL催乳素處理3 d后，收取樣品，在細(xì)胞中加入細(xì)胞裂解液，4℃離心1 500 r/min，10 min，取上清液。加入5×SDS上樣緩沖液混勻后，105℃變性10 min，蛋白樣品即制備完畢。同時(shí)提取豬乳汁蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照。
配制12%SDS-PAGE，電泳完畢后，將濾紙、分離膠浸泡于轉(zhuǎn)膜液中20 min。將PVDF膜放于100%甲醇中浸泡5 min，20%甲醇中浸泡2 min。處理完畢后，將三明治結(jié)構(gòu)放于半干轉(zhuǎn)膜裝置上，從負(fù)極開(kāi)始依次是:濾紙、分離膠、PVDF膜、濾紙，蓋上電極，接通電源，23 V電壓30 min。
轉(zhuǎn)膜完畢后，將PVDF膜置于平皿中，用10 mL TBST稀釋的5%脫脂奶封閉PVDF膜，室溫2 h。封閉完畢后，將PVDF膜置于平皿中，加入1∶500稀釋的抗CNS2抗體4℃孵育過(guò)夜。孵育完成后，使用TSBT洗膜3次，每次10 min。最后加入1∶5 000稀釋的山羊抗兔酶標(biāo)二抗，室溫孵育2 h。TBST洗膜3次，每次10 min。用ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色A液和B液等比例混合，均勻滴加到目的條帶處，曝光30 s，觀察結(jié)果。
1.3.9統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。使用SPSS 26.0軟件的單因素方差分析(ANOVA)檢查組間顯著性。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。以P<0.05表示差異顯著。
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