1.2方法
1.2.1 Sprodbtg基因的擴增
通過重疊PCR將SD序列和信號肽ΔS0949序列克隆于proD-BTG基因的N端，獲得目的基因。第1輪PCR以質(zhì)粒pET28a-prodbtg為模板，以P1、R1為引物擴增目的基因；第2輪PCR以第1輪擴增產(chǎn)物為模板，以P2、R1為引物擴增出最終目的基因含SD序列及ΔS0949全長序列的proD-BTG基因。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃10 min.
1.2.2重組質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg的構(gòu)建
經(jīng)切膠、回收、純化后的PCR產(chǎn)物（Sprodbtg基因）及pXMJ19質(zhì)粒均用HindⅢ和BamHⅠ進行雙酶切，分別回收酶切產(chǎn)物，經(jīng)純化后，用T4 DNA連接酶于16,℃連接過夜并轉(zhuǎn)化至E.coli JM109，然后涂布于含50μg/mL氯霉素的平板，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，酶切驗證。將驗證正確的重組質(zhì)粒命名為pXMJ19-Sprodbtg.
1.2.3重組菌株C.glutamicum ATCC13032/pXMJ 19-Sprodbtg的構(gòu)建
取6μL構(gòu)建好的質(zhì)粒pXMJ19-Sprodbtg電轉(zhuǎn)化至C.glutamicum ATCC13032感受態(tài)細胞，電擊條件同挑取轉(zhuǎn)化子酶切驗證，將驗證正確的重組菌株命名為C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg.質(zhì)粒pXMJ19轉(zhuǎn)化子C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19作為對照菌株。
1.2.4重組菌C.glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg及C.glutamicumATCC13032/pXMJ 19的誘導表達
分別挑取1環(huán)重組菌C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-Sprodbtg或C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19單菌落，分別接種于裝有50,mL LB培養(yǎng)基的250,mL三角瓶中，30℃、200,r/min振蕩培養(yǎng)過夜，以1%,的接種量分別轉(zhuǎn)接于裝有100 mL MMTG的500 mL三角瓶中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12,h，加入終濃度為1,mmol/L的IPTG誘導酶原蛋白proD-BTG的表達，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.分別取1 mL重組菌發(fā)酵液于12,000,r/min離心1,min，獲取上清液，向其中分別加入130μL 100%,TCA，冰上放置30 min，12,000,r/min離心5,min，棄去上清液，加1,mL丙酮洗滌2次。待丙酮揮發(fā)完全后，沉淀分別溶解于20,μL無菌蒸餾水中，各加入5,μL 5×SDS-PAGE電泳上樣緩沖液，沸水浴5,min，12,000,r/min離心10,min，分別取上清液進行SDS-PAGE分析。
1.2.5酶原蛋白proD-BTG的酶活力測定
含有酶原蛋白proD-BTG的發(fā)酵液通過4,000,r/min離心15,min回收上清液，一定量的Factor Xa加入到表達proD-BTG的重組谷氨酸棒桿菌上清液中切割重組蛋白。隨后通過熒光定量分析法分析酶原蛋白proD-BTG的酶活力。
酶活力檢測反應(yīng)體系：90,μL（5,mg/mL）的重組酶和1.98,mL 50,mmol/L Tris-HCl（pH,7.5）包括0.2%,N，N-二甲基酪蛋白，12.5,μmol/L丹磺尸胺（MDC），4.5,mmol/L DTT.反應(yīng)體系于37,℃反應(yīng)30,min，加入42,mmol/L（NH4）2SO4終止反應(yīng)，于激發(fā)波長350,nm下檢測發(fā)射波長500,nm下的熒光強度。
酶活力定義：每分鐘催化1 nmol/L的MDC插入到N，N-二甲基酪蛋白所需的酶量定義為1個活力單位（U）。
1.2.6重組菌C.glutamicumATCC13032/pXMJ19-Sprodbtg誘導條件的優(yōu)化
重組菌生長曲線的繪制：將培養(yǎng)過夜的菌液按1%,的接種量接入50,mL含有10,μg/mL氯霉素的MMTG培養(yǎng)中，30℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔一定時間取樣，以MMTG培養(yǎng)基為空白對照，檢測培養(yǎng)液600,nm下的吸光度。以該菌種培養(yǎng)時間為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制生長曲線。
最佳誘導時機的確定：分別在接種4、8、12、16、20,h后加入終濃度為1,mmol/L的IPTG開始誘導，30,℃誘導48,h，檢測分析誘導時機對proD-BTG表達量的影響。
最佳誘導時間的確定：在最佳誘導時機加入終濃度為1 mmol/L的IPTG開始誘導，30,℃誘導20、30、40、50、60 h，檢測分析誘導時機對proD-BTG表達量的變化。
IPTG最佳誘導濃度的確定：在最佳誘導時機加入終濃度分別為0.4、0.6、0.8、1.0、1.2,mmol/L的IPTG開始誘導，30,℃誘導至最佳時間，分析IPTG濃度對proD-BTG表達的影響。
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