2結(jié)果
2.1對生長曲線的影響
在一定范圍內(nèi)，菌液的細(xì)胞濃度與吸光度值（OD值）成正比，試驗中采用OD600來衡量重組大腸桿菌的細(xì)胞密度。因此，通過測定OD值的變化來間接地表示乙酸鈉對重組菌生長的抑制情況。
乙酸根對重組大腸桿菌生長曲線的影響結(jié)果（圖1）顯示，在培養(yǎng)基中加入乙酸鈉對BL21（DE3）/pET15b-Tres的生長會產(chǎn)生影響，菌體的生長明顯受到抑制，使得菌體生長的延滯期延長，且抑制作用隨濃度的增大而增強，而乙酸鈉濃度為0.5 g/L時，對菌體生長的抑制較弱，其他濃度下，0-6 h內(nèi)，生長較緩慢。在6 h之后，較低濃度（乙酸鈉濃度低于5 g/L）下，菌體生長受到的抑制減弱，而在較高濃度（乙酸鈉濃度為10、20和30 g/L）下，菌體生長被嚴(yán)重抑制，生長依然緩慢。
圖1不同濃度乙酸鈉對重組菌生長曲線的影響
2.2對細(xì)胞顯微特征的影響
經(jīng)電子顯微鏡觀察對照組的重組大腸桿菌的形態(tài)，如圖2中A-1、A-2所示，其細(xì)胞形態(tài)比較完整、飽滿。而試驗組中用不同濃度的乙酸、乙酸鈉處理過的重組菌，形態(tài)發(fā)生了不同的變化。其中，用濃度為6.25 g/L和25 g/L的乙酸處理過的菌體形態(tài)如圖2-B、2-C所示，用濃度分別為6.72 g/L和26.88 g/L的乙酸鈉溶液處理過的菌體形態(tài)如圖2-D、2-E所示。圖2-B顯示，菌體基本形態(tài)沒有較大變化，只出現(xiàn)較小的褶皺，而圖2-C中顯示菌體出現(xiàn)皺縮，菌體的形態(tài)受到較大影響。乙酸鈉處理后的細(xì)胞（圖2-D、2-E）顯示，細(xì)胞會發(fā)生凹陷，隨著乙酸鈉濃度的增大，細(xì)胞受損情況加重。
圖2環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察乙酸（鈉）對重組菌形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響
2.3對菌體細(xì)胞膜通透性的影響
通過測定菌液電導(dǎo)率的變化可以反映細(xì)菌細(xì)胞膜通透性的變化情況。重組菌經(jīng)不同濃度的乙酸、乙酸鈉處理后其菌液電導(dǎo)率的變化情況（圖3-A）表明，菌體加入無菌水的空白對照組電導(dǎo)率很低，而且變化不大，而實驗組加入不同濃度的乙酸鈉后，菌液的電導(dǎo)率發(fā)生了不同的變化。乙酸鈉是一種強電解質(zhì)，強電解質(zhì)溶液的電導(dǎo)率隨著濃度的增加而升高，當(dāng)濃度增加到一定程度后，解離度下降，離子運動速率降低，電導(dǎo)率也降低。相同濃度的菌液加入不同濃度的乙酸鈉后，電導(dǎo)率也變得不同，濃度為13.44 g/L時，電導(dǎo)率最大。濃度繼續(xù)升高電導(dǎo)率先降低后升高，可能是由于電解質(zhì)解離程度高使得乙酸根由于外界壓力進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，導(dǎo)致其先下降，而其他濃度的乙酸鈉加入后，會使得電導(dǎo)率有所升高，這說明乙酸根導(dǎo)致了細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，內(nèi)容物電解質(zhì)泄露到胞外，其電導(dǎo)率的變化程度相差不大。而圖3-B顯示，加入乙酸后，菌液的電導(dǎo)率均升高，初始電導(dǎo)率隨濃度的增大而增大，升高程度也隨濃度增大而略有增大，說明細(xì)胞膜的破壞程度略有增加。
2.4對菌體細(xì)胞膜完整性的影響
通過測定經(jīng)不同處理后的菌液上清在260 nm處的吸光度值變化推測菌體細(xì)胞膜的完整性變化情況。重組菌經(jīng)不同濃度的乙酸（鈉）處理后菌液上清的OD260變化情況（圖4-A）表明，空白對照組的菌液上清OD260沒有升高，且變化較小，而實驗組的OD260變化比較大，且高于對照組，說明實驗組的菌體細(xì)胞膜完整性受到影響，有DNA等物質(zhì)的泄露；由于乙酸鈉是強電解質(zhì)，濃度太高會抑制其電解率，而濃度為26.88 g/L和6.72 g/L時，趨勢相似，變化程度接近，推測其電解率相近。而濃度為13.44 g/L和3.36 g/L時，OD260值變化不大；濃度為13.44 g/L時，可能是由于乙酸鈉的電離及乙酸根的水解程度較大，會有大量的質(zhì)子化的乙酸根進(jìn)入細(xì)胞，對膜的完整性影響較小，而濃度為3.36 g/L時，濃度較低則對膜完整性的影響較小。乙酸添加情況（圖4-B）表明，前200 min，變化情況較復(fù)雜，無明顯的趨勢，之后可以看到試驗組的OD260高于對照組，且隨濃度增大而升高，說明乙酸會影響菌體細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致DNA等大分子物質(zhì)的泄露，且隨濃度升高作用增強。
圖3不同濃度乙酸鈉（A）及乙酸（B）對菌體細(xì)胞膜通透性的影響
圖4不同濃度乙酸鈉（A）及乙酸（B）對重組菌細(xì)胞膜完整性的影響
2.5對細(xì)胞內(nèi)膜的滲透性影響
通過測定菌液上清中的β-半乳糖苷酶的活性，來檢測胞內(nèi)大分子滲透至胞外的情況，進(jìn)而說明細(xì)胞內(nèi)膜的受損情況。菌液添加乙酸鈉作用后，離心菌體，取上清測定β-半乳糖苷酶的酶活性，結(jié)果（圖5）顯示，加入乙酸鈉作用于菌體后，上清中β-半乳糖苷酶的酶活高于對照組，說明乙酸根對于細(xì)胞內(nèi)膜有一定的破壞作用，導(dǎo)致β-半乳糖苷酶滲漏到胞外，而不同濃度的乙酸鈉對其作用效果相差不大。
2.6熒光分析法測乙酸對菌體膜蛋白構(gòu)象的影響
通過熒光分析法檢測乙酸對菌體上的膜蛋白及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果（圖6）表明，KI作用后，熒光強度降低，說明能與細(xì)胞膜表面的蛋白質(zhì)色氨酸Trp殘基結(jié)合，同時熒光強度逐漸降低，由此可以推斷，色氨酸Trp殘基位于細(xì)胞膜的表面和內(nèi)部，當(dāng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時，膜內(nèi)部的Trp殘基就會暴露出來與KI結(jié)合。圖7結(jié)果顯示，隨著乙酸濃度的增大，Trp殘基的熒光強度相應(yīng)的依次減少，表明乙酸對Trp的熒光特性具有淬滅作用。而激發(fā)峰的位置和圖形基本上沒有變化，這表明乙酸能夠改變細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，使位于細(xì)胞膜內(nèi)的Trp殘基暴露于細(xì)胞膜外。
2.7對蛋白質(zhì)合成的影響
圖8顯示，加入低濃度的乙酸鈉，海藻糖合酶的表達(dá)量會增大，推測是由于乙酸根進(jìn)入胞內(nèi)，會作為碳源參與到菌體的代謝中，因而其表達(dá)量增大，但隨著濃度的繼續(xù)增大，乙酸的抑制作用也會表現(xiàn)出來，海藻糖合酶的表達(dá)量則隨著乙酸鈉濃度的增大而減小，說明乙酸鈉會對海藻糖合酶的表達(dá)產(chǎn)生抑制。
圖8乙酸鈉作用后的重組菌蛋白SDS-PAGE電泳圖譜
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——摘要
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——材料與方法
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——結(jié)果
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達(dá)——討論、結(jié)論
相關(guān)新聞推薦
1、明永冰川地區(qū)低溫黃桿菌噬菌體生長曲線繪制及生物學(xué)特性（二）
2、基于MIC和生長曲線分析植物乳桿菌SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌的抑菌機理（二）
3、大腸桿菌GI698菌株在LB培養(yǎng)基中生長規(guī)律