1.3.2制備液化沙雷氏菌菌懸液
液化沙雷氏菌SCB2649菌株經(jīng)LB固體培養(yǎng)基活化2代后,用無菌接種環(huán)挑取單菌落一環(huán)于5 mL TSB液體培養(yǎng)基中,28℃培養(yǎng)20 h,6 000 r/min離心5 min,棄上清液,用無菌胰蛋白胨大豆肉湯稀釋至1～2×107CFU/mL,備用。
1.3.3最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)的測定
采用倍比稀釋法測定植物乳桿菌SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌的最小抑菌濃度[15]。取菌懸液100μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,再取溶于無菌去離子水的代謝物100μL加到上述孔中,使代謝物終質(zhì)量濃度分別為32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。對照組加入100μL去離子水和100μL菌懸液。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放置于28℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,培養(yǎng)后用肉眼觀察孔中菌液的濁度,選定菌液澄清透明的最低植物乳桿菌SCB2505代謝物濃度為MIC。
1.3.4 SCB2505對液化沙雷氏菌生長曲線的影響
參照石超[16]的方法并稍作修改。取1.3.2節(jié)所得菌懸液100μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,再取濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC代謝物溶液100μL加到上述孔中,使代謝物終質(zhì)量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對照,每個(gè)濃度3孔。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于28℃培養(yǎng)24 h,每間隔1 h測定1次OD600nm值,并以時(shí)間為橫坐標(biāo),光密度值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。
1.3.5植物乳桿菌代謝物的抑菌成分分析
1.3.5.1 SCB2505代謝物溶液的制備
用無菌去離子水溶解代謝物,使代謝物的質(zhì)量濃度為43 mg/mL,放置于4℃中待用。
1.3.5.2溫度敏感性測定
將LB培養(yǎng)基融化后待其冷卻至48～50℃,加入指示菌液化沙雷氏菌菌液,使培養(yǎng)基含菌量為5×105 CFU/mL,混勻后倒入平板,晾干后用打孔器(d=7.8 mm)在平板上打孔并挑去瓊脂塊。將1.3.5.1節(jié)制備的代謝物溶液分別在70、100、121℃加熱處理20 min,以未處理的代謝物溶液為對照,每孔滴加樣液90μL,于28℃培養(yǎng)10 h,測量抑菌圈直徑。
1.3.5.3 pH敏感性測定
采用1.3.5.2節(jié)的方法制備指示菌平板。用1 mol/L稀鹽酸、氫氧化鈉溶液調(diào)整代謝物溶液pH值分別為3.0、5.0、7.0、9.0,將乳酸(與未處理的代謝物溶液pH值一致)和未處理的代謝物溶液(pH 3.54)為對照,每孔滴加樣液90μL,于28℃培養(yǎng)10 h,測量抑菌圈直徑。
1.3.5.4乳酸驗(yàn)證試驗(yàn)
采用1.3.5.2節(jié)的方法制備指示菌平板。參考乳酸測試盒步驟進(jìn)行操作,測定20 mL植物乳桿菌SCB2505代謝物溶液中的乳酸含量。取試管,在A管中注入6 mL代謝物溶液,在B、E管中注入6 mL無菌MRS液體培養(yǎng)基,C、D管注入6 mL無菌水,然后用25%乳酸調(diào)節(jié)B管(同時(shí)記錄乳酸添加量)、C管至與A管相同pH,在D管中注入與B管等量的乳酸,實(shí)驗(yàn)以E管為空白對照,每孔滴加樣液90μL,28℃培養(yǎng)10 h,測量抑菌圈直徑。
1.3.5.5酶敏感性測定
采用1.3.5.2節(jié)的方法制備指示菌平板。將胰蛋白酶、胃蛋白酶、過氧化氫酶分別加入到裝有5 mL代謝物溶液的試管中,使各酶終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,用1 mol/L稀鹽酸、氫氧化鈉溶液分別將pH調(diào)整為8.0(胰蛋白酶)、1.8(胃蛋白酶)、過氧化氫酶(7.0),37℃水浴2 h,再用稀鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)至初始pH,以未進(jìn)行蛋白酶處理的代謝物溶液為對照,每孔滴加樣液90μL,28℃培養(yǎng)10 h,測量抑菌圈直徑。
1.3.6 SCB2505代謝物對液化沙雷氏菌生物被膜的影響
參考王琳等[17]的方法稍作修改。取1.3.2節(jié)所得菌懸液100μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,再取濃度分別為1.0 MIC、2.0 MIC和4.0 MIC代謝物溶液100μL加到上述孔中,使代謝物終質(zhì)量濃度分別為0.5 MIC、1.0 MIC、2.0 MIC,以無菌去離子水替代代謝物作為對照,每個(gè)濃度3孔。將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板于28℃培養(yǎng)24 h。然后棄去菌液,用PBS清洗3次,加入200μL甲醇固定15 min,后棄去甲醇,加入200μL 0.1%結(jié)晶紫染液染色20 min,棄去染色液,用PBS清洗3次,干燥后,加入200μL 95%乙醇溶液溶解殘留的染色液,用酶標(biāo)儀測定OD590nm值,計(jì)算生物被膜抑制率。生物被膜抑制率的計(jì)算如公式(1)所示:
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