利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)HPV疫苗是目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。目前國(guó)際上市的HPV疫苗采用真核表達(dá)系統(tǒng)，由于表達(dá)量低，培養(yǎng)成本高，大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)困難，使得產(chǎn)品成本高昂，限制了其在發(fā)展中國(guó)家的應(yīng)用[1-2]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)該疫苗研發(fā)多采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)，因其是目前人類掌握最成熟、應(yīng)用最廣的表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌因其培養(yǎng)要求低、遺傳背景清楚、表達(dá)量高及安全、成本低等優(yōu)點(diǎn)成為生命科學(xué)研究模式生物之一?；蚬こ叹l(fā)酵可獲得大量外源基因表達(dá)產(chǎn)物[3]，建立穩(wěn)定高效的高密度發(fā)酵工藝是實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)關(guān)鍵。本研究擬使用GI698菌株考察大腸桿菌在不同氧環(huán)境下生長(zhǎng)特性，觀察其在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)規(guī)律，尋找有利于疫苗株生長(zhǎng)培養(yǎng)方式，為疫苗大規(guī)模生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1儀器設(shè)備
醫(yī)用型潔凈工作臺(tái)（江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司，型號(hào)：SWCJ-1FD，批號(hào)：109659GC5186）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津，型號(hào)：UV-2450，批號(hào)：206-86430-93）；水浴恒溫振蕩器（常州市儀都儀器有限公司，型號(hào)：SHZ-82A，批號(hào)：無(wú)）。其余物料、耗材見(jiàn)表1。
表1主要物料、耗材
1.2菌種
大腸桿菌GI698菌株為實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性菌株。
1.3培養(yǎng)基
按表2配制Luria-Bertan（LB）培養(yǎng)基，三個(gè)搖瓶在工作過(guò)程，培養(yǎng)基中含氧量順序?yàn)椋簬醢蹇珊粑鼡u瓶＞帶檔板不可呼吸、普通搖瓶。
1.4方法
發(fā)酵方法：按表2配制LB培養(yǎng)基，分裝至3瓶1 L的三角瓶進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，裝液量為500 mL并高溫滅菌。凍存管保藏的大腸桿菌工作種子常溫解凍后，取5 mL初始葡萄糖分別加入三瓶搖瓶培養(yǎng)基中，每瓶接種750μL工作種子。兩個(gè)帶擋板三角燒瓶分別用帶濾膜瓶蓋和密封瓶蓋。三者置于30℃恒溫震蕩搖床培養(yǎng)。
檢測(cè)方法：間隔一定時(shí)間，取樣并稀釋至一定倍數(shù)（測(cè)定樣品的OD600值0.3～0.8之間），分光光度計(jì)測(cè)定吸光值。
2結(jié)果
在發(fā)酵前5 h，三種搖瓶生長(zhǎng)情況一致，處于生長(zhǎng)遲緩期。6 h后，均進(jìn)入對(duì)數(shù)期，兩個(gè)帶擋板燒瓶菌液OD值高于普通三角燒瓶。其中帶擋板可呼吸燒瓶菌液生長(zhǎng)情況最好，培養(yǎng)24 h后，其OD值比普通三角燒瓶、帶擋板密封燒瓶，分別要高出36.36%，16.00%。結(jié)果見(jiàn)表3。
三種培養(yǎng)模式過(guò)程中，前5 h菌體OD值變化不大，菌體細(xì)胞處于生長(zhǎng)遲緩期；6 h后生長(zhǎng)較快幾乎呈倍數(shù)生長(zhǎng)，表明菌體進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；9 h后生長(zhǎng)放緩，可能由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡以及有害代謝物質(zhì)（如乙酸）積累，影響生長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)幾個(gè)小時(shí)停滯期后，菌體再次開(kāi)始二次生長(zhǎng)。（結(jié)果見(jiàn)圖1）。
3討論
一般大腸桿菌生長(zhǎng)過(guò)程需要氧氣參與，溶解氧濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)物形成影響較大，尤其在高密度發(fā)酵中期菌體呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著菌體生長(zhǎng)，菌體密度升高，溶氧下降，生長(zhǎng)減慢，在發(fā)酵后期菌體耗氧極大，如果供氧不足就會(huì)導(dǎo)致表達(dá)量下降。對(duì)于不同菌株和不同表達(dá)產(chǎn)物需控制的溶氧值也不同，溶氧過(guò)高，會(huì)產(chǎn)生氧化物基、羥自由基等有害物質(zhì)引起氧中毒現(xiàn)象，從而影響生長(zhǎng)、表達(dá)。溶氧濃度過(guò)低會(huì)弱化TCA循環(huán)[4]，改變轉(zhuǎn)錄水平相關(guān)基因與葡萄糖和乙酸代謝，導(dǎo)致乙酸大量積累[5-6]。在發(fā)酵過(guò)程中要保證溶氧大于臨界氧濃度，可避免菌體因供氧不足或過(guò)量帶來(lái)的傷害。已有研究認(rèn)為在搖瓶中取樣時(shí)間超過(guò)2 min會(huì)造成缺氧，從而產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制，因而對(duì)搖瓶培養(yǎng)工藝研究應(yīng)特別注意因取樣發(fā)生的溶氧限制問(wèn)題[7]?？刂迫苎踔饕峭ㄟ^(guò)攪拌速度和通氣量實(shí)現(xiàn)，發(fā)酵前期，增大攪拌速度和通氣量使溶氧增加，發(fā)酵后期細(xì)胞濃度較高時(shí)，可通入純氧滿足對(duì)氧氣需求[8]。而這些因素又直接影響外源蛋白產(chǎn)量高低。本研究中隨著菌體進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，可呼吸燒瓶OD值比普通三角燒瓶、帶擋板密封燒瓶值要高出36.36%、16.00%。結(jié)果表明該菌株在耗氧情況下比厭氧情況下生長(zhǎng)更好。
表2 LB培養(yǎng)基配置表
表3 OD600檢測(cè)數(shù)據(jù)
圖1不同培養(yǎng)模式菌體生長(zhǎng)曲線
由于表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)外源基因不同，工程菌發(fā)酵模式是不固定的，但發(fā)酵過(guò)程中都必須考慮培養(yǎng)基組成[9]。根據(jù)組成成分，培養(yǎng)基可分為合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基。目前大腸桿菌高密度發(fā)酵常用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，其各組分的濃度和比例要適當(dāng)，過(guò)量營(yíng)養(yǎng)物會(huì)抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，尤其是碳源和氨源的比例[10-11]。在大腸桿菌高密度發(fā)酵中，通常需投入幾倍于生物量培養(yǎng)基質(zhì)，才能充分滿足高密度生長(zhǎng)及大量表達(dá)目標(biāo)蛋白需要。單純靠增加培養(yǎng)基質(zhì)并無(wú)法實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵[12-13]。本研究中菌體生長(zhǎng)遲緩期OD值變化均不大，經(jīng)歷了生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，隨后生長(zhǎng)放緩，可能由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡以及有害代謝物質(zhì)（如乙酸）積累，影響菌體生長(zhǎng)。經(jīng)幾個(gè)小時(shí)停滯期后，菌體再次開(kāi)始生長(zhǎng)，可能由于菌體細(xì)胞利用乙酸作為碳源，進(jìn)行二次生長(zhǎng)。結(jié)果提示大腸桿菌GI698菌株在LB培養(yǎng)基中可進(jìn)行第二次生長(zhǎng)。
綜上所述，本研究初步明確了大腸桿菌GI698菌株菌體在較高氧含量環(huán)境地帶擋板可呼吸搖瓶中能更好地生長(zhǎng)。大腸桿菌GI698菌株在LB培養(yǎng)基中能進(jìn)行第二次生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)工程菌發(fā)酵培養(yǎng)條件方式不斷研究改進(jìn)，科學(xué)控制發(fā)酵環(huán)節(jié)，有望實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物規(guī)?；a(chǎn)。
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