摘要：本文旨在研究發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸對重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS的生長以及重組海藻糖合酶基因表達的影響，并對其作用機理進行探討。
通過外源添加乙酸（鈉）的方法，研究了乙酸鈉對重組菌BL21（DE3）/pET15b-TreS生長曲線的影響；利用環(huán)境掃描電子顯微鏡，觀察了重組菌形態(tài)的變化情況；通過測定菌液的電導率值變化、菌液上清中OD260的變化，研究了乙酸（鈉）對菌體細胞膜滲透性、完整性的影響；通過測定菌液上清中β-半乳糖苷酶的活性檢測了乙酸鈉對菌體細胞內(nèi)膜的影響；利用熒光分析法檢測了乙酸對菌體膜蛋白構象的影響；采用SDS-PAGE電泳研究了乙酸鈉對菌體重組海藻糖合酶表達量的影響。結果表明，乙酸（鈉）會對重組菌的生長產(chǎn)生一定的抑制作用，可以導致菌體細胞的表面出現(xiàn)凹陷、皺縮；并會影響細胞膜的滲透性、完整性，使得一些細胞內(nèi)容物發(fā)生泄漏；影響細胞膜上的膜蛋白構象，對膜的結構造成一定程度的破壞；對重組海藻糖合酶的表達產(chǎn)生影響。乙酸（鈉）對重組菌菌體的生長及重組海藻糖合酶基因的表達有影響，并且菌體細胞膜是其作用的一個靶點。
目前，隨著重組DNA技術與發(fā)酵培養(yǎng)技術的迅速發(fā)展，利用基因工程菌獲得所需產(chǎn)品的技術日趨成熟。由于大腸桿菌具有遺傳特性較清楚、易培養(yǎng)、發(fā)酵周期短并能實現(xiàn)目的基因的高效表達等特性，因而被廣泛應用于基因工程菌的構建。而重組菌的高細胞密度發(fā)酵是獲得高外源蛋白產(chǎn)量的一種重要手段，能夠提高單位時間單位體積的外源蛋白產(chǎn)率，重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)一般指培養(yǎng)液中菌體干細胞重量（dry cell weight，DCW）達50 g/L以上。利用重組大腸桿菌進行高密度發(fā)酵可以有效地提高外源基因表達產(chǎn)物的產(chǎn)量，但是，大腸桿菌在進行高密度發(fā)酵時會產(chǎn)生代謝副產(chǎn)物乙酸，Han認為細菌在低比生長速率條件下通過氧化代謝作用產(chǎn)生的能量足以滿足合成和異化作用的需求，不會產(chǎn)生乙酸，而在高比生長速率時，大腸桿菌僅靠氧化代謝不能提供足夠的能量，必須通過乙酸生成途徑儲備ATP和NADH2。乙酸的生成需要兩個關鍵性的酶，磷酸轉乙酰酶（Pta）和乙酰激酶（Ack），它們催化葡萄糖代謝中從乙酰輔酶A生成乙酸的兩步酶促反應。然而，乙酸的產(chǎn)生和積累不僅會影響菌體生長，還會對菌體生長和重組基因的表達產(chǎn)生抑制。
EL-Mansi和Luli假設的乙酸抑制機理為：乙酸在中性pH環(huán)境中以離子化（CH3COO-）和質(zhì)子化（CH3COOH）兩種形式存在，質(zhì)子化的乙酸具有弱的親脂性可以穿過細胞質(zhì)膜進入胞內(nèi)，在胞內(nèi)（pH7.5）解離成CH3COO-和H+，這樣就降低了膜內(nèi)的pH值，使膜內(nèi)外的pH差（ΔpH）減小，減弱了質(zhì)子推動力，產(chǎn)生的能量就被大大減少了，擾亂了細胞的正常代謝和生理活性。而陰離子增加了細胞內(nèi)部滲透壓，并干擾甲硫氨酸的合成。有試驗證明，培養(yǎng)時pH越低，乙酸未解離形式含量越高，乙酸抑制作用就越強。
此外，研究表明，乙酸會影響數(shù)種蛋白和基因，特別是那些涉及大腸桿菌轉錄及翻譯機制、一般應激反應和調(diào)節(jié)的蛋白和基因。而且，乙酸對產(chǎn)重組蛋白的細胞抑制作用比對野生型的細胞抑制作用更強，同時細胞誘導表達蛋白后產(chǎn)生乙酸的臨界比生長速率更低。
在利用重組大腸桿菌BL21（DE3）/pET15b-TreS進行高密度發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖合酶的過程中，發(fā)酵液中會有大量代謝副產(chǎn)物乙酸的積累，而且會影響海藻糖合酶的酶活。根據(jù)這些檢測結果，本研究采取外源添加的方法，研究乙酸對重組大腸桿菌的生長及外源海藻糖合酶基因表達的影響，并分析其對細胞的抑制機理，包括對細胞膜、目的蛋白表達量的抑制作用，旨在為了解發(fā)酵過程中乙酸對菌體作用的機理，以控制培養(yǎng)條件，降低對菌體生長及產(chǎn)物產(chǎn)量的影響。
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——摘要
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——材料與方法
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——結果
高密度發(fā)酵的過程中乙酸抑制重組大腸桿菌生長及外源基因的表達——討論、結論
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