近日，浙江大學(xué)生命科學(xué)研究院蔣超課題組聯(lián)合北京大學(xué)第三醫(yī)院冷玉鑫課題組和中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院羅紅課題組，在Nature Communications雜志在線發(fā)表題為"Deep longitudinal lower respiratory tract microbiome profiling reveals genome-resolved functional and evolutionary dynamics in critical illness"的研究論文。該研究利用新型開發(fā)的低生物量微生物富集方法（Chelex100-based low-biomass microbial-enrichment method，CMEM），在基因組水平首次系統(tǒng)揭示了重癥監(jiān)護(hù)病房（ICU）患者下呼吸道微生物組的功能和進(jìn)化動(dòng)態(tài)，為重癥感染的精準(zhǔn)診斷和個(gè)性化治療提供了新思路。
摘要
下呼吸道感染（LRTIs）是全球性的主要健康問題，2019年已致約300萬人死亡。在重癥監(jiān)護(hù)室（ICU）中，患者感染醫(yī)院獲得性下呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)和病死率均顯著增加。研究顯示，健康人與患者的下呼吸道微生物群落存在顯著差異，提示微生物組在免疫穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，且可能是新的治療目標(biāo)。然而，目前對(duì)其認(rèn)識(shí)十分有限。在進(jìn)行相關(guān)研究時(shí)，實(shí)驗(yàn)過程中面臨諸多的挑戰(zhàn)，例如高豐度的宿主DNA污染問題、微生物生物量相對(duì)較低的情況，以及連續(xù)收集下呼吸道樣本所面臨的困難。
為此，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種基于Chelex-100的微生物富集方法（CMEM），有效去除宿主DNA并提高微生物DNA產(chǎn)出，使得能直接從臨床下呼吸道樣本構(gòu)建微生物基因組，進(jìn)行全基因組水平的系統(tǒng)分析。通過CMEM技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)處理了來自中國三家醫(yī)院的157名ICU患者的453個(gè)下呼吸道樣本，重構(gòu)了120個(gè)高質(zhì)量的宏基因組及其質(zhì)粒序列。該研究揭示了肺炎患者下呼吸道微生物群落的物種級(jí)別特征和抗性基因，并發(fā)現(xiàn)了是否確診肺炎、ICU住院時(shí)間與特定抗性基因豐度的增加相關(guān)。此外，研究團(tuán)隊(duì)還觀察到機(jī)會(huì)致病菌的抗性和毒力基因組的菌株特異性，以及質(zhì)粒的保守進(jìn)化。綜上，該研究結(jié)果不僅提供了醫(yī)院內(nèi)菌株傳播的新視角，還展示了CMEM方法在ICU患者下呼吸道微生物監(jiān)測和研究中的應(yīng)用潛力。
關(guān)鍵點(diǎn)
CMEM方法的開發(fā)：結(jié)合基于皂苷的宿主DNA去除技術(shù)以及Chelex 100的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)重癥病房患者下呼吸道微生物組的深度測序和菌株水平分析。
重癥監(jiān)護(hù)病房特異性微生物特征：揭示了不同ICU內(nèi)患者特有的微生物組成，以及不同醫(yī)院的ICU之間在主要機(jī)會(huì)致病菌和抗生素抗性基因上的顯著差異。
臨床數(shù)據(jù)整合分析：結(jié)合臨床數(shù)據(jù)揭示了不同的下呼吸道微生物組的動(dòng)態(tài)變化模式可能與患者更嚴(yán)重的肺功能障礙和更強(qiáng)的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。
菌株水平全景分析：基于菌株水平的分析描繪了重癥監(jiān)護(hù)病房患者下呼吸道微生物群落的基因組功能、傳播及進(jìn)化特征的全景圖。
引言
下呼吸道感染是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域面臨的主要挑戰(zhàn)之一。2019年，因下呼吸道感染導(dǎo)致的死亡人數(shù)高達(dá)300萬，使其成為全球致死率最高的傳染病。ICU患者罹患醫(yī)院獲得性下呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)比普通人群高出3到10倍，并且與之相關(guān)的病死率顯著升高。研究表明，ICU患者的下呼吸道微生物群落與健康個(gè)體存在顯著差異，提示下呼吸道微生物組在維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用，并有望成為新的治療靶點(diǎn)。然而，目前對(duì)ICU患者下呼吸道微生物組的理解仍然有限，關(guān)于其縱向動(dòng)態(tài)變化、與宿主相互作用以及病原菌在臨床環(huán)境中進(jìn)化適應(yīng)的研究十分有限。
實(shí)驗(yàn)方法上面臨諸多挑戰(zhàn)，包括口腔共生菌和宿主DNA污染、微生物生物量低，以及縱向樣本采集困難等問題。大多數(shù)研究采用16S rRNA等擴(kuò)增子測序技術(shù)，但這種方法存在明顯的PCR偏好性、難以實(shí)現(xiàn)全面物種鑒定及功能和進(jìn)化分析等方面的局限。此外，由于痰液易受口腔菌群污染而支氣管肺泡灌洗液（BALF）取樣具有創(chuàng)傷性，使得獲取連續(xù)時(shí)間點(diǎn)的高質(zhì)量樣本變得十分困難。
傳統(tǒng)上，人們主要依賴微生物培養(yǎng)的方法來診斷下呼吸道微生物、獲取全基因組信息及進(jìn)行功能表征。但是，微生物培養(yǎng)方法不僅需要了解特定菌種的生長條件，而且工作量大，因此能夠被深入研究的菌種數(shù)量非常有限。相比之下，宏基因組學(xué)方法能夠在測序深度足夠的情況下生成近似不同物種基因組信息的高質(zhì)量宏基因組裝基因組（MAGs），從而克服了上述限制。盡管如此，基于MAGs開展的下呼吸道微生物研究仍相對(duì)匱乏。
研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用CMEM方法處理了來自中國三家醫(yī)院的157名重癥監(jiān)護(hù)病房患者的453個(gè)縱向下呼吸道抽出物樣本。通過高通量測序和后續(xù)的宏基因組組裝，我們無需傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)技術(shù)，便成功重構(gòu)了120個(gè)高質(zhì)量的宏基因組組裝基因組及其相關(guān)的質(zhì)粒序列。借助對(duì)下呼吸道樣本進(jìn)行深度測序的數(shù)據(jù)，研究團(tuán)隊(duì)成功地對(duì)ICU患者下呼吸道中的微生物群落進(jìn)行了全面的物種級(jí)別分析。該研究在肺炎患者群體中揭示了顯著的醫(yī)院特異性機(jī)會(huì)致病菌物種特征和抗性基因特征；通過縱向動(dòng)態(tài)采樣，進(jìn)一步觀察到肺炎患者下呼吸道內(nèi)機(jī)會(huì)致病菌物種特征隨時(shí)間發(fā)生分化的現(xiàn)象。經(jīng)過深入探究，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)是否確診肺炎以及患者在重癥監(jiān)護(hù)病房的停留時(shí)長，均與某些特定的抗生素耐藥基因的豐度具有顯著的相關(guān)性。
研究團(tuán)隊(duì)基于MAGs的分析揭示了機(jī)會(huì)致病菌中不同菌株之間存在菌株特異性的抗性基因組和毒力基因組；并通過進(jìn)化分析觀察到，在廣泛流行的機(jī)會(huì)致病菌中，可移動(dòng)基因元件的數(shù)量顯著增加，同時(shí)部分質(zhì)粒在數(shù)十年的進(jìn)化過程中顯示出高度的保守性。此外，研究團(tuán)隊(duì)還成功鑒定了鮑曼不動(dòng)桿菌和肺炎克雷伯菌中的新型重組熱點(diǎn)區(qū)域，并發(fā)現(xiàn)位于這些重組熱點(diǎn)區(qū)域的基因功能與接合元件（conjugative elements）和前噬菌（prophages）有密切關(guān)聯(lián)。最終，結(jié)合流行病學(xué)數(shù)據(jù)和微生物培養(yǎng)數(shù)據(jù)的綜合分析，研究團(tuán)隊(duì)揭示了重癥監(jiān)護(hù)室內(nèi)患者間菌株傳播現(xiàn)象的頻繁發(fā)生，為深入理解和闡釋醫(yī)院內(nèi)病原菌感染的傳播機(jī)制提供了新的視角。
結(jié)果
CMEM的開發(fā)及其在下呼吸道微生物組深度測序中的應(yīng)用
研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種名為CMEM的方法，該方法能夠顯著提高去除宿主DNA后的微生物DNA產(chǎn)量（圖1a）。這一改進(jìn)極大地提升了可檢測到的微生物DNA產(chǎn)率。簡而言之，該研究采用了一種改良的皂苷基差分裂解法來去除人源DNA，并通過降低皂苷濃度優(yōu)化了此過程以減少對(duì)微生物群落可能造成的損失。為應(yīng)對(duì)下呼吸道樣本中低微生物生物量帶來的挑戰(zhàn)，研究團(tuán)隊(duì)在處理過程中加入了超聲破碎步驟以促進(jìn)微生物細(xì)胞裂解。隨后，利用常用于法醫(yī)調(diào)查中的Chelex 100提取極少量的微生物DNA，最終得到適用于深度宏基因組測序的高質(zhì)量DNA（圖1a）。與Qiagen Power Water及Qiagen Allprep DNA/RNA試劑盒進(jìn)行的直接對(duì)比顯示，CMEM產(chǎn)生的最終DNA產(chǎn)量明顯更高，并且顯著增加了可檢測到的DNA回收率。由于CMEM在DNA產(chǎn)出方面的高效率，對(duì)于下呼吸道樣本構(gòu)建測序文庫時(shí)平均僅需5輪擴(kuò)增循環(huán)，這大大減少了先前研究中處理低生物量樣本時(shí)PCR擴(kuò)增引入的偏差。此外，整個(gè)CMEM流程在一個(gè)單管內(nèi)完成，簡化操作的同時(shí)也最大限度地減少了DNA損失以及轉(zhuǎn)移過程中潛在污染的風(fēng)險(xiǎn)。
相關(guān)新聞推薦
1、不同pH、Na2CO3、NaCl濃度對(duì)耐鹽堿菌株NM-1生長曲線的影響——材料與方法
2、水飛薊賓聯(lián)合臨床常用抗菌素對(duì)感染細(xì)菌的體外抑制作用
3、人參外泌體改變巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的生長的分子機(jī)制（四）