2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測人參外泌體對(duì)RAW264.7細(xì)胞極化的影響
人參外泌體作用于RAW264.7細(xì)胞后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測M1型巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志CD80的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖3），與空白對(duì)照組相比，經(jīng)過不同濃度的人參外泌體處理后，M1型巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志CD80顯著升高（P<0.05），且具有濃度依賴性，濃度為20μg/mL時(shí)，M1型型巨噬細(xì)胞分子標(biāo)志CD80上調(diào)最為顯著（P<0.01），濃度為10μg/mL時(shí)次之。這表明人參外泌體可以有效的刺激巨噬細(xì)胞向M1方向極化。
圖3流式細(xì)胞術(shù)檢測人參外泌體對(duì)RAW264.7細(xì)胞極化的影響
注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.001。
2.4人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞M1極化對(duì)A549細(xì)胞活力的影響
A549細(xì)胞與條件培養(yǎng)基共培養(yǎng)后，使用CCK-8檢測A549細(xì)胞的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖4），與空白對(duì)照組相比，LPS組A549細(xì)胞活力受到抑制（P<0.001）；與空白對(duì)照組相比，隨著人參外泌體給藥濃度的增加，A549細(xì)胞活力呈梯度下降，人參外泌體濃度為20μg·mL?1時(shí)，A549細(xì)胞的細(xì)胞活力最低（P<0.001），其次是人參外泌體濃度為10μg·mL?1（P<0.001），人參外泌體濃度為5μg·mL?1（P<0.001）時(shí)抑制能力最弱；這表明人參外泌體可以顯著抑制A549細(xì)胞的生長，減弱腫瘤細(xì)胞A549的增殖能力。
圖4人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞M1極化對(duì)A549細(xì)胞活力的影響
注：與空白對(duì)照組相比，***P<0.001。
2.5人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞極化對(duì)A549細(xì)胞周期的影響
腫瘤細(xì)胞的快速增殖與細(xì)胞周期的進(jìn)程密切相關(guān)，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，促進(jìn)其快速凋亡是目前腫瘤治療的重要研究方向[26]，細(xì)胞周期一般分為G0、G1、S、G2和M期，主要受c-myc、cyclin A、cyclin D1等基因調(diào)控[27]，主要細(xì)胞分裂過程中發(fā)生的細(xì)胞周期停滯引起的損傷和錯(cuò)誤很難修復(fù)[28]。通過流式細(xì)胞儀檢測A549細(xì)胞的細(xì)胞周期，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（圖5），與空白對(duì)照組相比，LPS組A549細(xì)胞的G1期細(xì)胞數(shù)目增多（P<0.01），S期細(xì)胞數(shù)目減少；與空白對(duì)照組相比，人參外泌體中劑量組與人參外泌體高劑量A549細(xì)胞處于G1期細(xì)胞數(shù)目增多（P<0.05），S期的細(xì)胞數(shù)目顯著減少（P<0.05）。這意味著人參外泌體在G1期阻斷了A549細(xì)胞的細(xì)胞周期，從而阻止了DNA的正常復(fù)制，抑制了腫瘤的生長。
圖5人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞極化對(duì)A549細(xì)胞周期的影響
注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。
2.6人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞極化對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響
細(xì)胞周期進(jìn)程被阻滯后，將會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，凋亡是通過激活內(nèi)在自殺機(jī)制而誘發(fā)的細(xì)胞程序性死亡過程。采用流式細(xì)胞儀檢測人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞M1極化對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響（圖6），與空白對(duì)照組相比，LPS組凋亡的細(xì)胞比例顯著升高（P<0.01）；與空白對(duì)照組相比，人參外泌體給藥組細(xì)胞凋亡的比例顯著升高，人參外泌體的濃度為10μg·mL?1凋亡的細(xì)胞比例最高（P<0.01），其次是人參外泌體濃度為20μg·mL?1，人參外泌體濃度為5μg·mL?1凋亡的細(xì)胞比例最低（P<0.01）。這表明人參外泌體通過刺激巨噬細(xì)胞M1極化從而有效地誘導(dǎo)了A549細(xì)胞的凋亡。
圖6人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞極化對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響
注：與空白對(duì)照組相比，**P<0.01。
2.7人參外泌體通過激活TLR4/MyD88信號(hào)通路促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡
TLR4信號(hào)可以通過MyD88和TRIF途徑傳遞。MyD88通路通過募集IL-1受體相關(guān)激酶（IRAK-κ）誘導(dǎo)NF-κB的早期激活。IRAK蛋白與TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）相互作用并激活。TRAF6招募并激活TAK1。TAK1激活了核因子κB激酶（IKK），然后NF-κB結(jié)合抑制蛋白IκB被IKK磷酸化，隨后泛素化和降解，導(dǎo)致NF-κB的二聚體p65-p50失去抑制作用，然后發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用，進(jìn)入細(xì)胞核驅(qū)動(dòng)炎性胞質(zhì)分裂的轉(zhuǎn)錄基因。NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，NF-κB的活化將導(dǎo)致iNOS、COX-2蛋白表達(dá)增加。為了進(jìn)一步明確人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞極化抑制A549細(xì)胞增殖的內(nèi)在機(jī)制，采用Western blot檢測A549細(xì)胞中TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示（圖7），與空白對(duì)照組相比，LPS組和不同劑量的人參外泌體給藥組TLR4、MyD88、NF-κB、iNOS、COX-2蛋白表達(dá)均增加。其中NF-κB的表達(dá)具有明顯的濃度依賴性，與空白對(duì)照組相比，人參外泌體高劑量組NF-κB的表達(dá)最高（P<0.01），中劑量組次之（P<0.01），低劑量組NF-κB的表達(dá)最低（P<0.01）。
圖7人參外泌體刺激巨噬細(xì)胞M1極化對(duì)A549細(xì)胞TLR4/MyD88通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響
注：與空白對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。
3.結(jié)論
本次實(shí)驗(yàn)?zāi)M腫瘤微環(huán)境，收集LPS和人參外泌體處理的RAW264.7細(xì)胞衍生的上清液，制成CM并與A549共培養(yǎng)，首次證實(shí)了人參外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，激活TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)水平，顯著抑制A549細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)A549細(xì)胞周期，從而誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，本研究對(duì)人參外泌體在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）相關(guān)疾病的治療領(lǐng)域奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步探索人參外泌體在TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路方面的相關(guān)研究提供了理論支持。但人參外泌體促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化后M1型巨噬細(xì)胞所占比例尚不明確，我們將繼續(xù)深入研究M1型巨噬細(xì)胞與A549細(xì)胞之間相互作用的具體機(jī)制。
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