摘要：目的:1.探討水飛薊賓對臨床常見感染細(xì)菌的體外抑菌活性及抑菌譜。2.探討水飛薊賓與臨床常用抗菌素的聯(lián)合作用。3.研究水飛薊賓的抑菌機(jī)制。
為開發(fā)新型抗菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。方法:
1.水飛薊賓的抑菌活性檢測
(1)采用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓及其同分異構(gòu)體(異水飛薊賓、水飛薊寧、水飛薊亭)對臨床常見感染細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌)標(biāo)準(zhǔn)菌株的最低抑菌濃度(MIC)。平行測定3次,取平均值。(2)采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定不同濃度水飛薊賓對臨床常見感染細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株生長曲線的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(3)采用微量肉湯稀釋法測定水飛薊賓對常見感染細(xì)菌臨床分離菌株的最低抑菌濃度(MIC)。平行測定3次,取平均值。(4)采用棋盤微量肉湯稀釋法進(jìn)行水飛薊賓與臨床常用抗菌素(革蘭陽性菌選用青霉素和紅霉素,革蘭陰性菌選用慶大霉素和環(huán)丙沙星)聯(lián)合藥敏試驗(yàn),測定在聯(lián)合用藥的情況下,水飛薊賓對細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC)及抗菌素對細(xì)菌的最低抑菌濃度(MIC),并計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)(FIC)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
2.水飛薊賓的抑菌機(jī)制研究
(1)水飛薊賓對表皮葡萄球菌細(xì)胞膜完整性的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細(xì)菌0 h、0.5 h、1 h、2 h、3 h、5 h、7 h和9 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后取樣,使用考馬斯亮蘭-分光光度法分別檢測各作用時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌培養(yǎng)液中胞外蛋白濃度(平行測3次),繪制蛋白濃度—作用時(shí)間曲線,并比較實(shí)驗(yàn)組與對照組的差異性。(2)水飛薊賓對表皮葡萄球菌菌體蛋白代謝的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細(xì)菌12 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后,將各菌懸液稀釋到相同濃度(相同OD值),取等體積離心,制備菌體可溶性蛋白,然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,對凝膠圖譜進(jìn)行拍照分析。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。(3)水飛薊賓對表皮葡萄球菌核酸代謝的影響:1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別在37℃作用細(xì)菌6 h、12 h、24 h和48 h(對照組用無菌水代替水飛薊賓)后取樣,將各菌懸液稀釋到相同濃度(相同OD值)后,各取等體積的量與DAPI染液反應(yīng),然后于熒光分光光度計(jì)上分別測定菌體的DNA熒光強(qiáng)度和RNA熒光強(qiáng)度(平行測3次),并采用SPSS 21.0對二者結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)水飛薊賓對表皮葡萄球菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶活性的影響:pBR322 DNA主要以超螺旋形式(FormⅠ)存在,而拓?fù)洚悩?gòu)酶可以將pBR322 DNA超螺旋形式解旋為開環(huán)或線性DNA(FormⅡ)。1 MIC和2 MIC水飛薊賓分別于37℃對細(xì)菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶和pBR322 DNA混合物作用30 min(對照組用DMSO代替水飛薊賓)后,通過凝膠電泳及凝膠成像系統(tǒng)觀察pBR322 DNA存在的形式,獲得水飛薊賓對表皮葡萄球菌DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(5)水飛薊賓對表皮葡萄球菌生物膜的影響:用1 MBIC和2 MBIC水飛薊賓分別作用于各階段(6 h、24 h和48 h)的生物膜,于37℃培養(yǎng)過夜。然后,用結(jié)晶紫染色法對生物膜進(jìn)行半定量測定,運(yùn)用SPSS 21.0對吸光度值進(jìn)行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;最后用激光共聚焦技術(shù)直接觀察水飛薊賓對生物膜形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
結(jié)果:1.水飛薊賓的抑菌活性(1)水飛薊賓對革蘭陽性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的最小抑菌濃度(MIC)范圍為50-400μg/mL,其中對表皮葡萄球菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑菌活性,MIC值為50μg/mL,而該藥對革蘭陰性菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MIC值范圍為>400μg/mL;在水飛薊賓的同分異構(gòu)體中,異水飛薊賓對表皮葡萄球菌、屎腸球菌和糞腸球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC均為400μg/mL,其他同分異構(gòu)體對臨床常見感染細(xì)菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值均>400μg/mL。(2)水飛薊賓對表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌生長曲線有明顯的抑制作用,且隨著藥物濃度的增加,抑制效果越顯著,而該藥對大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的生長曲線沒有任何影響。(3)水飛薊賓對臨床分離革蘭陽性菌株的MIC值:表皮葡萄球菌為≥100μg/mL,金黃色葡萄球菌、糞腸球菌和屎腸球菌均為≥400μg/mL;水飛薊賓對臨床分離革蘭陰性菌株的MIC值均>400μg/mL。(4)在聯(lián)合藥敏試驗(yàn)中,對于革蘭陽性菌,水飛薊賓與青霉素/紅霉素的聯(lián)合抑菌指數(shù)均以0.5
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