1.3 方法
1.3.1 動(dòng)物雙歧桿菌NX-6的菌株特性測(cè)定
1.3.1.1 生長曲線測(cè)定
取—80 ℃凍存的動(dòng)物雙歧桿菌NX-6解凍后接種于BS固體培養(yǎng)基上，置于厭氧工作站中（溫度37 ℃、相對(duì)濕度65%、氧氣相對(duì)含量0.0%）培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落接種于BS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，設(shè)置3 個(gè)平行組，每2 h取樣于600 nm波長處測(cè)定OD值，繪制生長曲線。
1.3.1.2 人工胃腸液耐受實(shí)驗(yàn)
取—80 ℃凍存的動(dòng)物雙歧桿菌NX-6解凍后接種于BS固體培養(yǎng)基，放置于厭氧工作站中（溫度37 ℃、相對(duì)濕度65%、氧氣相對(duì)含量0.0%）培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于BS液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h作為種子液。取10 mL種子液離心（6 000 r/min、4 ℃）10 min棄去上清液得菌泥，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2 次后將菌泥重懸于人工胃液（或人工腸液）中，37 ℃消化3 h，在厭氧工作站中分別于0 h和3 h取樣，調(diào)整菌懸液濃度為10—6～10—7 CFU/mL，涂布于BS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后測(cè)定活菌數(shù)，按式（1）計(jì)算存活率：
式中：N為0 h時(shí)NX-6的活菌數(shù)/（CFU/mL）；N*為3 h時(shí)NX-6的活菌數(shù)/（CFU/mL）。
1.3.1.3 菌株全基因組學(xué)測(cè)序、組裝和注釋
取一定量動(dòng)物雙歧桿菌NX-6種子液離心并用PBS洗滌菌泥2 次，再次離心棄去上清液，將菌體送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序，具體步驟包括提取基因組DNA、基因組打斷、末端修復(fù)、加測(cè)序接頭、純化DNA和上機(jī)測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行基因組裝分析、基因組注釋、基因功能注釋、特殊結(jié)果預(yù)測(cè)，其中基因功能注釋使用了非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫、京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫、直系同源集（Cluster of Orthologous Groups，COG）數(shù)據(jù)庫、碳水化合物酶相關(guān)的專業(yè)數(shù)據(jù)庫、蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫、致病菌毒力因子（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB）數(shù)據(jù)庫等。
1.3.2 斑馬魚降脂功效實(shí)驗(yàn)
1.3.2.1 樣品配制
用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）配制質(zhì)量濃度為24 mg/mL的阿托伐他汀鈣母液，置于4 ℃冰箱備用。實(shí)驗(yàn)時(shí)調(diào)整阿托伐他汀鈣溶液質(zhì)量濃度為2.4 μg/mL；稱取0.5 g油紅O加入100 mL 1,2-丙二醇溶液中，常溫下用磁力攪拌器避光攪拌8 h，充分溶解，再用定性濾紙過濾染液，配成新鮮油紅O染液；養(yǎng)殖水配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%葡萄糖溶液；取1.3.1.2節(jié)的種子液2 mL，在4 ℃、6 000 r/min條件下離心10 min棄上清液得菌泥，用PBS洗滌2 次，E3養(yǎng)殖水重懸，分別配制成濃度分別為1×104、1×105、1×106 CFU/mL的動(dòng)物雙岐桿菌NX-6菌液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.3.2.2 模型構(gòu)建與藥品干預(yù)
將每組25 尾受精后5 h的斑馬魚置于6 孔板中，空白組加入4 mL E3養(yǎng)殖水并投喂斑馬魚魚苗正常飼料，其余組加入4 mL葡萄糖溶液并投喂斑馬魚高脂飼料，28 ℃孵育5 d，每天更換新的溶液。完成模型構(gòu)建后，棄去上述溶液，空白組和模型組加入4 mL E3養(yǎng)殖水，陽性組加入4 mL阿托伐他汀鈣溶液，NX-6低濃度組加入4 mL菌液（1×104 CFU/mL），NX-6中濃度組加入4 mL菌液（1×105 CFU/mL），NX-6高濃度組加入4 mL菌液（1×106 CFU/mL）。各組于28 ℃孵育72 h，每孔每天投喂5 mg飼料并更換新鮮溶液，除空白組喂食斑馬魚正常飼料外，其他組均繼續(xù)投喂高脂飼料，通過油紅O染色情況和TG、TC檢測(cè)結(jié)果判定高脂模型構(gòu)建是否成功。
1.3.2.3 油紅O染色
孵育結(jié)束后使用E3養(yǎng)殖水沖洗幼魚，將幼魚收集于1.5 mL離心管中，加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，4 ℃固定1 d。將離心管中固定的幼魚倒入24 孔板中，E3養(yǎng)殖水沖洗2 次，用不同體積分?jǐn)?shù)的1,2-丙二醇溶液按以下順序進(jìn)行滲透：25% 1,2-丙二醇溶液處理25 min→50%1,2-丙二醇溶液處理25 min→75% 1,2-丙二醇溶液處理25 min→100% 1,2-丙二醇溶液處理25 min。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%油紅O染液2 mL（幼魚完全浸沒），錫紙避光，室溫染色過夜。洗掉染液，加入體積分?jǐn)?shù)為100% 1,2-丙二醇溶液，去背景色20 min（在顯微鏡下觀察去背景的效果）。在顯微鏡下拍照觀察斑馬魚幼魚染色情況（脂肪細(xì)胞和肝臟脂肪變性染色呈紅色）。采用ImageJ 6.0軟件進(jìn)行圖像分析并采集數(shù)據(jù)，分析統(tǒng)計(jì)斑馬魚尾部血管血脂光密度總和（S），根據(jù)光密度總和的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果按式（2）計(jì)算相對(duì)脂肪水平，以評(píng)價(jià)動(dòng)物雙岐桿菌NX-6的降血脂作用。
1.3.3 非靶向代謝組學(xué)分析
取1 mL NX-6發(fā)酵上清液（記為NX組），加1 mL甲醇-乙腈溶液（2∶1，V/V）和35 μL 0.3 mg/mL內(nèi)標(biāo)（L-2-氯苯丙氨酸，用甲醇溶液配制），渦旋振蕩至無結(jié)塊的固液混合物。在冰水浴中超聲提取15 min，再渦旋振蕩10 min，—20 ℃靜置20 min。在15 000 r/min、4 ℃條件下離心5 min，取200 μL上清液進(jìn)樣測(cè)試。以空白BS培養(yǎng)基作為對(duì)照（記為BS組），所有樣本的提取液分別取30 μL混合制備成質(zhì)控樣本。色譜柱選用AQUITY UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）。流動(dòng)相A為水（含0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.1%甲酸），梯度洗脫程序：0～1 min，98% A、2% B；1～9 min，98%～2% A、2%～98% B；9～12 min，2% A、98% B；12～12.1 min，2%～98% A、98%～2% B；12.1～15 min，98% A、2% B。流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣體積4 μL。質(zhì)譜采用雙電噴霧離子源，使用Auto MS/MS采集模式，掃描范圍為m/z 500～1 300，干燥氣流速為8 L/min，干燥氣溫度為320 ℃，鞘氣流速12 L/min，鞘氣溫度為350 ℃，毛細(xì)管電壓為4 000 V，噴嘴電壓為1 000 V，碰撞能量為10/40 V。
1.3.4 斑馬魚體內(nèi)的2-吲哚酮、吲哚-3-甲酸含量測(cè)定
隨機(jī)挑選受精后5 d野生型AB系斑馬魚置于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔30 尾，設(shè)置模型組、BS組、NX-6組，每組3 個(gè)重復(fù)孔。按上述步驟構(gòu)建模型，構(gòu)建結(jié)束后正常組加入E3養(yǎng)殖水并投喂正常飼料，模型組加入E3養(yǎng)殖水并投喂高脂飼料，BS組加入空白BS培養(yǎng)基，NX-6組加入濃度為1×106 CFU/mL NX-6菌液并投喂高脂飼料，每孔每天投喂5 mg飼料并更換新鮮溶液，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中孵育14 d。干預(yù)結(jié)束后，每孔隨機(jī)挑選20 尾斑馬魚，超純水洗滌3 次后，轉(zhuǎn)移斑馬魚至1.5 mL EP管中加入PBS并勻漿，取50 μL勻漿液加入300 μL沉淀劑，渦旋5 min混勻后在4 ℃、15 000 r/min條件下離心10 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）分析（標(biāo)準(zhǔn)曲線同步操作），運(yùn)用LC-MS/MS儀檢測(cè)提取液中2-吲哚酮、吲哚-3-甲酸的濃度。
1.3.5 斑馬魚中TG與TC含量測(cè)定
構(gòu)建高脂血癥斑馬魚模型，設(shè)置空白組（150 mL 0.01% DMSO＋正常飼料）、模型組（150 mL 0.01%DMSO＋高脂飼料）、陽性組（150 mL 2.5 μg/mL阿托伐他汀鈣溶液＋斑馬魚高脂飼料）和實(shí)驗(yàn)組（150 mL 1×104、1×105、1×106 CFU/mL NX-6菌液＋斑馬魚高脂飼料或25、50、100 μmol/L吲哚-3-甲酸），各組在28 ℃條件下孵育14 d。干預(yù)結(jié)束后，收集斑馬魚于2 mL EP管中（每組30 尾/管），吸凈離心管中的液體，每管加入200 μL PBS，使用組織均質(zhì)研磨儀將收集到的斑馬魚勻漿破碎，直至無明顯組織碎塊，4 ℃、10 000 r/min離心10 min后取上清液，按照試劑盒說明書分別測(cè)定TG、TC含量。
1.4 數(shù)據(jù)處理與分析
采用GraphPad Prism 6.0軟件統(tǒng)計(jì)處理數(shù)據(jù)，結(jié)果用表示。
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