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MCPC微凝膠可恢復(fù)腸道微生物失調(diào)并促進(jìn)SCFA產(chǎn)生

來(lái)源：發(fā)布時(shí)間:2024-07-30 14:22:13 瀏覽：467 次

CRISPR系統(tǒng)是原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可以保護(hù)宿主細(xì)胞免受外來(lái)DNA的入侵。作為噬菌體和細(xì)菌免疫系統(tǒng)之間持續(xù)斗爭(zhēng)的一部分，CRISPR系統(tǒng)已演變成各種類型，每種類型都具有不同的功能。II型Cas9是這些系統(tǒng)中研究最廣泛的，并且具有多種亞型。目前尚不確定該家族的成員是否能夠進(jìn)化出額外的機(jī)制來(lái)對(duì)抗病毒入侵。在這里研究人員鑒定了2,062個(gè)完整的Cas9位點(diǎn)，預(yù)測(cè)其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，并揭示了II-C型Cas9的三種結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)軌跡。我們發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因(NAG)往往存在于較大的II-C Cas9的基因座內(nèi)。進(jìn)一步研究表明，來(lái)自金黃桿菌屬的CbCas9含有一個(gè)新的β-REC2結(jié)構(gòu)域，并與II-C Cas9(PcrIIC1)的NAG編碼的CRISPR–Cas系統(tǒng)促進(jìn)(pro-CRISPR)蛋白形成異四聚體復(fù)合物。

與獨(dú)立的CbCas9相比，CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合和切割活性、對(duì)原型間隔子相鄰基序序列的更廣泛的兼容性、對(duì)錯(cuò)配的耐受性增強(qiáng)以及抗噬菌體免疫力的提高?？傮w而言，我們的工作在結(jié)構(gòu)水平上揭示了II-C Cas9蛋白的多樣性和“生長(zhǎng)進(jìn)化”軌跡，并鑒定了許多NAG，例如PcrIIC1，它作為前CRISPR因子來(lái)增強(qiáng)CRISPR介導(dǎo)的免疫。

Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用

Bioscreen C是一種微生物生長(zhǎng)曲線分析儀，用于監(jiān)測(cè)大腸桿菌（E.coli）在不同條件下的生長(zhǎng)情況，生長(zhǎng)條件是在37°C下培養(yǎng)，并每2小時(shí)測(cè)量一次OD600nm值。Bioscreen C用于測(cè)定在體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)中，含有不同質(zhì)粒（如表達(dá)MBP、SUMO、PcrIIC1或VapC毒素）的E.coli BW25141細(xì)胞在葡萄糖抑制蛋白表達(dá)或阿拉伯糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)條件下的吸光度（OD600nm）隨時(shí)間的變化。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

成功制備了機(jī)械強(qiáng)度高的MCPC微凝膠，該微凝膠通過酚類金屬配位框架穩(wěn)定，用于益生菌和多酚的共同遞送。該微凝膠具有增強(qiáng)的益生菌胃酸保護(hù)、腸道響應(yīng)釋放和粘膜粘附特性的組合。棕色生物活性物質(zhì)天然結(jié)合在MCP多糖上，事實(shí)證明，MCP多糖是提高阿克曼氏菌豐度的精確益生元。MCPC/AKK通過依次在腸道中提供活性AKK并在肝臟中提供棕色抗氧化劑，有效改善APAP誘導(dǎo)的肝損傷。MCPC微凝膠在腸道中的高活性AKK可以恢復(fù)腸道微生物失調(diào)并促進(jìn)SCFA產(chǎn)生，從而增強(qiáng)肝功能，調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥，并通過腸肝軸修復(fù)腸道屏障。

圖1、大型II-C Cas9與鄰近的NAG相關(guān)并表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)軌跡。a)示意圖顯示已識(shí)別的II-A、II-B、II-C型和NAG相關(guān)II-C系統(tǒng)的CRISPR-Cas9系統(tǒng)的數(shù)量。顯示了GEM和HBGC數(shù)據(jù)集中已識(shí)別系統(tǒng)的數(shù)量。b)具有（NAG+）和不具有（NAG?）NAG的II-C Cas9的蛋白質(zhì)大小的比較。NAG+的中值為1,463個(gè)氨基酸，NAG?的中值為1,159個(gè)氨基酸。使用雙邊檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并通過曼-惠特尼U檢驗(yàn)確定顯著性。c)所有已識(shí)別的NAG的功能注釋。具有核酸結(jié)合功能的NAG呈紅色。d)示意圖顯示了II-C Cas9結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、量化和降維分析的工作流程。PCA，主成分分析。e)II-C Cas9s蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的SGT分析平面。點(diǎn)的大小對(duì)應(yīng)于Cas9的大小，顏色對(duì)應(yīng)于SGT的偽時(shí)間。每個(gè)簇的標(biāo)簽根據(jù)軌跡著色。f)每個(gè)軌跡的高級(jí)簇中的代表性Cas9結(jié)構(gòu)。NAG+Cas9的比例標(biāo)記在頂部，不同簇中Cas9的總數(shù)標(biāo)記在每個(gè)簇的底部。

圖2、CbCas9三元和CbCas9-PcrIIC1四元復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)。a)CbCas9 PAM偏好。左圖是隨機(jī)質(zhì)粒去除測(cè)定的示意圖。右圖是CbCas9 PAM偏好的WebLogo圖。數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。b)CbCas9域組織的示意圖。c)根據(jù)b著色的完整R環(huán)（左）和部分R環(huán)（右）CbCas9三元復(fù)合物(CbCas9-sgRNA-dsDNA)的原子模型。HNH和CTH是無(wú)序的，不包含在兩個(gè)模型中。β-REC2中潛在的DNA結(jié)合賴氨酸殘基在部分R環(huán)CbCas9三元復(fù)合物中用綠色球體標(biāo)記。d)CbCas9–PcrIIC1–sgRNA–dsDNA四元復(fù)合物（28 bp dsDNA底物）的冷凍電鏡圖（頂部）和原子模型（底部）。e)由兩個(gè)對(duì)稱CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子結(jié)合的兩個(gè)dsDNA底物（20-nt互補(bǔ)）的卡通圖。f)PcrIIC1二聚體和兩個(gè)CTH結(jié)構(gòu)域的原子模型，以及PcrIIC1和Mg 2+離子的冷凍電鏡圖（半透明）。與活性口袋中的Mg 2+相互作用的殘基以紅色顯示。g)描述CbCas9的CTH結(jié)構(gòu)域和PcrIIC1的NCP之間結(jié)合的局部結(jié)構(gòu)模型。

圖3、PcrIIC1增強(qiáng)CbCas9的體外DNA干擾活性。a，CbCas9和CbCas9-PcrIIC1 PAM偏好的WebLogo圖。數(shù)據(jù)代表具有相似結(jié)果的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。b，熱圖顯示CbCas9-PcrIIC1和CbCas9之間PAM偏好的倍數(shù)變化。與CbCas9組相比，較暖的顏色表明CbCas9-PcrIIC1組對(duì)PAM的偏好增加。c，CbCas9和CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子對(duì)含有各種PAM（ACAAA、ACAAC和ACGTC）的靶dsDNA進(jìn)行體外切割的模型（左）和效率圖（右）；在0、2、5、15、30、60、90和120分鐘時(shí)收集等分試樣。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3個(gè)獨(dú)立重復(fù)）。CbCas9的每個(gè)PAM的平臺(tái)值分別為66.88、46.98和26.77，CbCas9-PcrIIC1的每個(gè)PAM的平臺(tái)值分別為71.84、65.37和53.15。Cb和Cb+P分別表示CbCas9和CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子。d，使用CbCas9和CTH突變的CbCas9（CbCas9-CTH mut；K1431E、K1433E、K1435E和R1442E）使用ACAAC PAM對(duì)目標(biāo)dsDNA進(jìn)行的模型（左）和切割效率圖（右），在有或沒有PcrIIC1的情況下孵育；在0、2、5、15、30、60、90和120分鐘時(shí)收集等分試樣。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3個(gè)獨(dú)立重復(fù)）。Cb-CTH mut和Cb-CTH mut+P分別表示CTH突變的CbCas9和CTH突變的CbCas9-PcrIIC1效應(yīng)子。e，左圖，用于目標(biāo)dsDNA的R環(huán)形成的smFRET測(cè)定示意圖，其中TS上有Cy3標(biāo)記，NTS上有Cy5標(biāo)記。右圖為僅DNA、PcrIIC1、dCbCas9和dCbCas9-PcrIIC1樣品的FRET直方圖。

圖4：CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物通過兩個(gè)CbCas9效應(yīng)子增強(qiáng)dsDNA篩選和dsDNA入侵能力。a，CbCas9-PcrIIC1-sgRNA-dsDNA非靶向復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)以半透明冷凍電鏡圖顯示，核酸以原子模型顯示。b，a中CbCas9-PcrIIC1非靶向復(fù)合物的側(cè)視圖。B型DNA模擬物顯示為半透明模型。c，非靶向復(fù)合物中CbCas9-PcrIIC1與dsDNA靶標(biāo)結(jié)合的示意圖。d，CbCas9-PcrIIC1-sgRNA-dsDNA（對(duì)稱20-nt互補(bǔ)）雙靶向復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)以半透明冷凍電鏡圖顯示，核酸以原子模型顯示。e，雙靶向復(fù)合物中CbCas9-PcrIIC1結(jié)合dsDNA靶標(biāo)的示意圖。f，含有兩種不同原型間隔子（原型間隔子-1（紅色）和原型間隔子-2（藍(lán)色）的Fam標(biāo)記的靶dsDNA的體外切割。右下角是不同裂解產(chǎn)物的圖表。g，示意圖顯示CbCas9的單鏈搜索和CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物的雙鏈搜索。

圖5、通過與MCPC介導(dǎo)的相互作用增強(qiáng)腸道粘膜粘附和益生菌定植。A)粘膜粘附曲線，B)MCPC和MCP對(duì)大鼠腸粘膜的最大分離力(MSF)和總粘附功(TAW)。C)MCPC濃度對(duì)粘液粘附益生菌影響的菌落計(jì)數(shù)。D)粘液（用綠色Alexa Fluor 488-WGA標(biāo)記）滲透無(wú)紅色和嵌入NZ9000的CLSM 3D圖像。E)FITC標(biāo)記的游離WCFS1或MCPC/WCFS1在胃腸道中的滯留。F)紅色游離NZ9000或MCPC/NZ9000在腸粘液中的分布。空腸粘液用綠色Alexa Fluor 488-WGA染色，腸絨毛細(xì)胞核用藍(lán)色DAPI染色。G)小鼠糞便中各種AKK的菌落計(jì)數(shù)。

總結(jié)

CRISPR系統(tǒng)是原核生物（如細(xì)菌）中的一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能夠保護(hù)宿主細(xì)胞免受外來(lái)DNA的入侵，尤其是噬菌體的攻擊。研究者們鑒定了2,062個(gè)完整的Cas9位點(diǎn)，并預(yù)測(cè)了其相關(guān)蛋白的結(jié)構(gòu)，揭示了II-C型Cas9的三種結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)軌跡。研究發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)基因（NAG）通常存在于較大的II-C型Cas9的基因座內(nèi)。特別是來(lái)自金黃桿菌屬的CbCas9含有一個(gè)新的β-REC2結(jié)構(gòu)域，并與PcrIIC1蛋白形成異四聚體復(fù)合物。PcrIIC1蛋白是一種無(wú)毒的核酸酶，對(duì)單鏈DNA(ssDNA)和單鏈RNA(ssRNA)具有核酸酶活性，但其生物學(xué)作用與典型的PIN域毒素不同。CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物表現(xiàn)出增強(qiáng)的DNA結(jié)合和切割活性，對(duì)原型間隔子相鄰基序（PAM）序列的更廣泛兼容性，對(duì)錯(cuò)配的耐受性增強(qiáng)，從而提高了抗噬菌體免疫力。通過冷凍電鏡分析，研究者們揭示了CbCas9-PcrIIC1復(fù)合物的詳細(xì)結(jié)構(gòu)，包括它們?nèi)绾螀f(xié)同作用于長(zhǎng)dsDNA底物，以及如何通過雙重靶向來(lái)增強(qiáng)DNA干擾能力。研究提供了關(guān)于II-C型Cas9蛋白從緊湊到大型的進(jìn)化生長(zhǎng)軌跡的新視角，并探討了這些進(jìn)化趨勢(shì)與細(xì)菌宿主的進(jìn)化關(guān)系。PcrIIC1蛋白的發(fā)現(xiàn)不僅增進(jìn)了研究人員對(duì)細(xì)菌免疫機(jī)制的理解，而且為CRISPR-Cas9系統(tǒng)在生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供了新的可能性，尤其是在提高基因編輯精度和適應(yīng)性方面。研究運(yùn)用了多種先進(jìn)的生物信息學(xué)工具和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如AlphaFold2結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、冷凍電鏡（cryo-EM）和單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移（smFRET）等，來(lái)揭示Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)和功能。本項(xiàng)研究不僅在結(jié)構(gòu)水平上揭示了II-C Cas9蛋白的多樣性，而且鑒定了PcrIIC1這樣的新型CRISPR相關(guān)蛋白，為理解CRISPR-Cas系統(tǒng)的進(jìn)化和功能提供了重要信息，并為未來(lái)的生物技術(shù)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

MCPC微凝膠可恢復(fù)腸道微生物失調(diào)并促進(jìn)SCFA產(chǎn)生

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