摘要
在不同環(huán)境條件下（pH 4.5至7，NaCl濃度0.5%至8%，30°C），測(cè)定了接種單細(xì)胞李斯特?zé)o害菌（Listeria innocua）的孔洞產(chǎn)生濁度的時(shí)間分布。通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析確定，檢測(cè)時(shí)間T變異性的主要來(lái)源是單個(gè)細(xì)胞延滯時(shí)間（lag time）的變異性。檢測(cè)時(shí)間與其標(biāo)準(zhǔn)差之間存在線性關(guān)系dev(T)~T。在生長(zhǎng)緩慢的條件下，其他變異來(lái)源的影響逐漸顯著。
1.引言
濁度測(cè)量被用作傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)的替代方法，用于估計(jì)細(xì)菌的生長(zhǎng)參數(shù)（McMeekin等，1993）。隨著預(yù)測(cè)微生物學(xué)的新趨勢(shì)開(kāi)始關(guān)注細(xì)菌對(duì)食品環(huán)境反應(yīng)的變異性量化，其應(yīng)用日益增加。這在微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究中尤為重要。自動(dòng)化濁度測(cè)量系統(tǒng)能夠產(chǎn)生大量重復(fù)觀測(cè)數(shù)據(jù)，這對(duì)方差分析計(jì)算至關(guān)重要。
濁度是入射光強(qiáng)度與培養(yǎng)物散射光強(qiáng)度之比。在較高細(xì)胞密度（10.0至10.5 CFU/ml）時(shí)，它遵循比爾定律，即濁度與細(xì)胞濃度成正比（McMeekin等，1993；Begot等，1996）。比例范圍取決于細(xì)菌的大小和形狀，而這些又受環(huán)境條件的影響。例如，單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）在乳酸存在下具有很窄的線性范圍（Le Marc，2002）。細(xì)胞濃度與濁度之間的相關(guān)性（也稱(chēng)為校準(zhǔn)）取決于細(xì)菌種類(lèi)，有時(shí)甚至取決于所使用的特定菌株（Begot等，1996）。由于濁度與細(xì)胞濃度之間存在可接受關(guān)系的范圍有限，生長(zhǎng)參數(shù)的估計(jì)常常不準(zhǔn)確。
一些作者將光密度（OD）曲線的參數(shù)直接與“真實(shí)”（活菌計(jì)數(shù)）比生長(zhǎng)速率和延滯時(shí)間聯(lián)系起來(lái)（例如Dalgaard等，1994；Begot等，1996；Augustin等，1999；Dalgaard和Koutsoumanis，2001）。他們將生長(zhǎng)曲線擬合到OD值，并通過(guò)校準(zhǔn)使用這些曲線描述細(xì)胞濃度的增加。在大多數(shù)（但非所有）條件下，結(jié)果相當(dāng)良好（Dalgaard和Koutsoumanis，2001）。作為替代方案，其他作者提出使用觀測(cè)到的檢測(cè)時(shí)間（即細(xì)胞群體達(dá)到可檢測(cè)濁度水平所需的時(shí)間），而不是整個(gè)濁度生長(zhǎng)曲線（Cuppers和Smelt，1993；McClure等，1993；Augustin等，1999；Baranyi和Pin，1999；McKellar和Knight，2000）。將檢測(cè)時(shí)間對(duì)初始細(xì)胞濃度作圖，應(yīng)得到一條直線，其斜率與比生長(zhǎng)速率成反比。該技術(shù)用于本研究中對(duì)單個(gè)細(xì)胞延滯時(shí)間的群體內(nèi)方差分析。
傳統(tǒng)上，延滯期在“細(xì)胞濃度對(duì)數(shù)-時(shí)間”曲線上定義。延滯期結(jié)束時(shí)間是生長(zhǎng)曲線指數(shù)期切線與接種物水平相交的時(shí)間點(diǎn)。Baranyi和Roberts（1995）提出了一個(gè)更機(jī)械化的定義。引入了初始生理狀態(tài)參數(shù)（a?），延滯期計(jì)算為a?及后續(xù)比生長(zhǎng)速率的函數(shù)。
單個(gè)細(xì)胞的延滯時(shí)間與群體延滯期之間的聯(lián)系并不直接。Baranyi（1998,2002）和Baranyi和Pin（2001）分析了這一點(diǎn)，并推導(dǎo)出一個(gè)數(shù)學(xué)公式，將個(gè)體延滯時(shí)間的分布與整個(gè)群體的延滯期聯(lián)系起來(lái)。該公式意味著，個(gè)體延滯時(shí)間的平均值可能遠(yuǎn)長(zhǎng)于群體水平觀測(cè)到的延滯期，盡管個(gè)體生理狀態(tài)參數(shù)的平均值與群體的生理狀態(tài)參數(shù)相同。此外，從延滯期到指數(shù)期的過(guò)渡曲線可以通過(guò)個(gè)體延滯時(shí)間分布的變換獲得，但就當(dāng)前可用數(shù)據(jù)的精度而言，從群體生長(zhǎng)曲線推斷個(gè)體延滯時(shí)間的分布是不可能的。因此，使用傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)無(wú)法研究單個(gè)細(xì)胞的延滯時(shí)間。自動(dòng)化濁度測(cè)量可能提供解決方案，因?yàn)樗鼈冞m合產(chǎn)生大量重復(fù)檢測(cè)時(shí)間測(cè)量數(shù)據(jù)。如果每個(gè)觀測(cè)培養(yǎng)物從一個(gè)單細(xì)胞開(kāi)始，那么檢測(cè)時(shí)間的分布應(yīng)接近初始單個(gè)細(xì)胞延滯時(shí)間的分布，假設(shè)由單細(xì)胞產(chǎn)生的每個(gè)群體的比生長(zhǎng)速率相同且恒定。
本文通過(guò)單細(xì)胞生成的亞群體產(chǎn)生的濁度檢測(cè)時(shí)間，確定了李斯特?zé)o害菌的個(gè)體延滯時(shí)間。細(xì)胞經(jīng)受不同pH和NaCl濃度處理，并通過(guò)統(tǒng)計(jì)方法分析這些環(huán)境因素對(duì)所得分布的影響。
2.材料與方法
2.1.實(shí)驗(yàn)
2.1.1.菌株
使用李斯特?zé)o害菌（L.innocua）作為測(cè)試生物，因?yàn)樗僮靼踩揖哂信c食品病原體單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）相似的特性，后者是食品工業(yè)的主要關(guān)注點(diǎn)。李斯特?zé)o害菌菌株NCTC 11288，血清型6a，保存在3°C存儲(chǔ)的胰蛋白胨大豆瓊脂斜面（TSA,Oxoid）上。
2.1.2.生長(zhǎng)曲線
將L.innocua從儲(chǔ)備斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)至胰蛋白胨大豆肉湯（TSB），并在30°C培養(yǎng)24小時(shí)。將培養(yǎng)物用蛋白胨鹽稀釋液（PSDF）按1:1000稀釋?zhuān)?0μl接種到50 ml測(cè)試培養(yǎng)基中。測(cè)試培養(yǎng)基為補(bǔ)充了1%葡萄糖和0.3%酵母提取物（TSYGB,Oxoid）的TSB。用1 M HCl調(diào)節(jié)pH至7.0、5.5、5.0和4.5。在pH 7.0肉湯中添加NaCl，使最終濃度分別為4%、6%和8%NaCl（w/v）。
在接種后立即以及在水浴30°C培養(yǎng)長(zhǎng)達(dá)72小時(shí)期間間隔取樣。樣品在PSDF中稀釋?zhuān)⑼坎嫉饺齻€(gè)TSA平板上進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。
2.1.3.生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖谦@得許多單獨(dú)體積的培養(yǎng)基，平均接種一至兩個(gè)細(xì)胞。
將L.innocua從儲(chǔ)備斜面?zhèn)鞔囵B(yǎng)至TSB，并在30°C培養(yǎng)24小時(shí)至穩(wěn)定期。將培養(yǎng)物在PSDF中稀釋至20個(gè)細(xì)胞ml^{-1}。將稀釋培養(yǎng)物接種到兩個(gè)百孔板的孔中（每孔50mu l）。然后每孔加入350mu l測(cè)試培養(yǎng)基（TSYGB pH 7.0，添加或不添加NaCl；或pH 5.5、5.0、4.5，不添加NaCl）。將加滿(mǎn)的板置于Bioscreen C自動(dòng)讀數(shù)儀（Labsystems）中，在30{}^{circ}C培養(yǎng)。在長(zhǎng)達(dá)7天的時(shí)間內(nèi)定期在600~nm波長(zhǎng)下監(jiān)測(cè)濁度。
為了估計(jì)接種到每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)量，將接種物培養(yǎng)物的稀釋液涂布到TSA平板上，在30{}^{circ}C培養(yǎng)2天。
每種環(huán)境條件下實(shí)驗(yàn)重復(fù)兩到三次。
2.1.4.檢測(cè)時(shí)間
檢測(cè)時(shí)間是孔內(nèi)濁度達(dá)到0.11所需的時(shí)間。這對(duì)應(yīng)于10^{7}個(gè)細(xì)胞ml^{-1}的濃度，并通過(guò)每種環(huán)境條件下的活菌計(jì)數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。
2.1.5.讀數(shù)準(zhǔn)確性
通過(guò)在與生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)相同的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)檢查Bioscreen讀數(shù)的準(zhǔn)確性，但使用10^{7}個(gè)細(xì)胞ml^{-1}而不是20個(gè)。在最佳條件下，大群體的延滯期應(yīng)是恒定的，因此孔間的變異性即為Bioscreen讀數(shù)的變異性。
2.2.理論
?比生長(zhǎng)速率在群體中是同質(zhì)的，并且在初始細(xì)胞第一次分裂后是恒定的；
?每孔初始細(xì)胞數(shù)N_{0}遵循泊松分布。
我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證：
?檢測(cè)水平對(duì)應(yīng)于相同的細(xì)胞密度，無(wú)論研究條件如何。
?Bioscreen的OD測(cè)量不準(zhǔn)確性（噪聲）不顯著。
?在相同生長(zhǎng)條件下，檢測(cè)時(shí)間值是可重復(fù)的。
相關(guān)新聞推薦
1、淡腌黃魚(yú)微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的初步研究
2、蝦醬制作工藝，接種發(fā)酵劑對(duì)蝦醬微生物菌群多樣性的影響
3、生長(zhǎng)曲線分析儀：測(cè)定不同TIR防御系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)對(duì)噬菌體感染的反應(yīng)