桑黃（Phellinus baumii.）是一種食藥用真菌，利用沸水可提取其子實(shí)體抑菌成分。通過選取乳制品中常見的、具有代表性的有害指示菌，研究了不同濃度的桑黃水提物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌，霉菌和酵母的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)：桑黃水提物在1—10 mg/mL作用濃度下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)牛乳中有害細(xì)菌、真菌有效的抑制，能顯著控制巴殺牛乳中菌群總數(shù)的變化，同時(shí)對(duì)有益菌無顯著影響，相對(duì)Nisin等抑菌劑具有廣譜抑菌性。
隨著國(guó)民經(jīng)濟(jì)的不斷提高，我國(guó)乳品行業(yè)已步入了快速發(fā)展時(shí)期，消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)乳制品的品質(zhì)要求也在不斷提高。開發(fā)針對(duì)不同消費(fèi)人群的、具有特殊生理功能的高品質(zhì)乳制品成為我國(guó)乳業(yè)發(fā)展的一個(gè)新方向。而目前國(guó)內(nèi)外乳品微生物污染事故頻發(fā)，如2000年日本雪印旗下三款產(chǎn)品檢出金黃色葡萄球菌超標(biāo)，2002年美國(guó)惠氏生產(chǎn)的乳粉被檢出阪崎桿菌超標(biāo)等［1］。由于乳制品中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、乳糖、維生素等，在乳制品的生產(chǎn)流通以及儲(chǔ)存過程容易受到微生物的污染。因而，抑菌問題成為開發(fā)特色高品質(zhì)乳制品重要的環(huán)節(jié)之一。
乳制品的抑菌方式主要有內(nèi)源成分抑菌和外源物質(zhì)添加抑菌［2］。如目前研究最深、應(yīng)用最廣的是乳酸鏈球菌肽（Nisin），Nisin能有效地控制食品中的有害細(xì)菌［3］，特別是耐熱的芽孢桿菌及梭菌的生長(zhǎng)和繁殖，以達(dá)到延長(zhǎng)不同乳制品貨架期的目的。Nisin能夠有效控制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)繁殖，但對(duì)革蘭氏陰性菌、酵母以及霉菌不具有抑制作用［4-5］。因而，與乳制品內(nèi)源性抑菌物質(zhì)相比，外源添加抑菌成分有作用范圍小、不具廣譜抑菌性的弊端。開發(fā)一種天然、安全的外源抑菌成分應(yīng)用于乳制品的抑菌具有重要的意義。
桑黃（Phellinus spp.）作為一種珍貴的傳統(tǒng)食藥用真菌，是國(guó)際認(rèn)同的食品領(lǐng)域中相率最高的一種食藥用真菌［6-7］。目前，對(duì)于桑黃子實(shí)體水提物的生物活性有諸多報(bào)道，如抗氧化［8］、抗腫瘤［9］、抗衰老、提高免疫力、抗纖維化、抗肺炎［10-13］等功效。本研究通過研究桑黃子實(shí)體水提物的抑菌性，并應(yīng)用于乳制品，考察桑黃子實(shí)體水提物對(duì)保鮮乳中菌群總數(shù)的影響，旨在為開發(fā)一種天然、安全、性能佳的乳制品抑菌劑做部分基礎(chǔ)工作。
1材料與方法
1．1原料與儀器
PDA培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，按藥品說明取固體粉末加去離子水溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；MRS培養(yǎng)基、M17培養(yǎng)基購(gòu)于德國(guó)默克公司，按藥品說明取固體粉末溶解后，121℃滅菌15 min后，待用；指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、宋內(nèi)氏志賀氏菌（Shigella Castellani）、沙門氏菌（Salmonella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、青霉（Penicillium candidum）、白霉（Geotrichum candidum）、酵母菌種（Saccharomyces cerevisiae）保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）以及雙歧桿菌（Bifidobacterium），以上菌種保存于光明乳業(yè)股份有限公司菌種庫(kù)；桑黃（Phellinus baumii.）保存于中國(guó)微生物菌種保藏中心上海食用菌分中心。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀，購(gòu)于芬蘭Bioscreen公司；高壓蒸汽滅菌鍋HVE-50，購(gòu)于HIRAYAMA公司；超凈工作臺(tái)TH-CB-402，購(gòu)于LABCONCO公司。
1．2桑黃水提物的制備
將桑黃菌種栽培得到子實(shí)體后，將子實(shí)體粉碎至約1 cm3的顆粒，在干燥的子實(shí)體粉碎物中加入20倍體積的去離子水，沸水提取2 h，濾得殘?jiān)M(jìn)行二次提?。缓喜纱翁崛∫翰⑦M(jìn)行濃縮，4 000 r/min離心10 min去除沉淀；將乙醇加入濃縮液中，至乙醇終濃度為90%，室溫下靜置24 h后，將離心后沉淀部分加去離子水溶解，再次離心去除不溶物質(zhì)；將上清進(jìn)行透析12 h，透析后溶液進(jìn)行冷凍干燥，即得桑黃水溶性提取物，115℃滅菌15 min后使用。
1．3革蘭氏陰性菌抑制試驗(yàn)
抑菌方法參照Z(yǔ)HAO［14］并稍作改動(dòng)。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取大腸桿菌、宋內(nèi)氏志賀氏菌、沙門氏菌分別進(jìn)行菌種復(fù)蘇后，將菌體接種于液體肉湯培養(yǎng)基37℃下振蕩培養(yǎng)18 h，調(diào)節(jié)培養(yǎng)后菌液中菌種濃度為105—106個(gè)/mL，取1 mL調(diào)節(jié)后菌液與呈液態(tài)的肉湯瓊脂培養(yǎng)基混合均勻后倒至培養(yǎng)皿中；待培養(yǎng)基凝固后，將20μL不同濃度桑黃水提物溶液滴在混有有害微生物的固體培養(yǎng)基上，以20μL無菌水作為對(duì)照組；37℃下靜置培養(yǎng)48 h后測(cè)量平板抑菌圈大小。
1．4革蘭氏陽(yáng)性菌抑制試驗(yàn)
抑菌方法參照Z(yǔ)HAO［14］并稍作改動(dòng)。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL、20 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌以及枯草芽孢桿菌分別進(jìn)行菌種復(fù)蘇，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗(yàn)”。
1．5霉菌抑制試驗(yàn)
參照文獻(xiàn)［15］的方法，并略做改動(dòng)。將滅菌后桑黃水提物與PDA培養(yǎng)基混合均勻，使桑黃水提物終濃度為0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL，倒入平板凝固后，以空白PDA固體培養(yǎng)基為對(duì)照；取青霉、白霉菌株分別進(jìn)行活化并進(jìn)行固體擴(kuò)大培養(yǎng)，7 d后分別挑取青霉、白霉菌種于平板中心，30℃培養(yǎng)7 d后，分別測(cè)量青霉、白霉在平板中的直徑。
1．6酵母生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)
取啤酒酵母菌種進(jìn)行復(fù)活，挑取活化后的釀酒酵母擴(kuò)大培養(yǎng)，調(diào)節(jié)酵母菌體濃度為105—106個(gè)/mL并取180μL酵母發(fā)酵液與20μL桑黃水提物溶液均勻混合，置于Bioscreen10×10孔板，使樣品終濃度分別為4 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL，以無菌水作為空白對(duì)照，30℃連續(xù)震蕩，寬波長(zhǎng)于600 nm吸光度，間隔20 min讀數(shù)，連續(xù)測(cè)定2 000 min。
1．7巴氏殺菌乳菌群總數(shù)的控制
將滅菌后的桑黃水提物與新鮮牛乳混合均勻，使樣品在牛乳中的終濃度為0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、5 mg/mL，均質(zhì)后進(jìn)行巴氏殺菌，置于10℃下保存，按國(guó)標(biāo)“GB 47892—2010食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)”方法測(cè)定牛乳中細(xì)菌總數(shù)，連續(xù)測(cè)定2周。
1．8有益菌的影響
抑菌方法參照Z(yǔ)HAO［14］并稍作改動(dòng)。取桑黃水提物分別用無菌去離子水配制成1 mg/mL、10 mg/mL、50 mg/mL溶液，待用；取保加利亞乳桿菌（MRS培養(yǎng)基）、嗜熱鏈球菌（M17培養(yǎng)基）以及雙歧桿菌（MRS培養(yǎng)基）三種有益菌株復(fù)蘇擴(kuò)大培養(yǎng)，其余步驟參照“1.3革蘭氏陰性菌抑制試驗(yàn)”。
不同濃度的桑黃水提物對(duì)乳制品中有害指示菌的生長(zhǎng)抑制作用（實(shí)驗(yàn)儀器與方法）
不同濃度的桑黃水提物對(duì)乳制品中有害指示菌的生長(zhǎng)抑制作用（實(shí)驗(yàn)結(jié)果與結(jié)論）
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