1.2.2噬菌體的電鏡觀察參照J(rèn)ohnson等的研究方法對(duì)純化后的根瘤菌噬菌體進(jìn)行電鏡觀察，取濃縮后10μL的噬菌體溶液滴在銅網(wǎng)上沉淀20min,用濾紙片于銅網(wǎng)的側(cè)面將液體小心吸出。隨
后將吸干的銅網(wǎng)浸入到10μL磷鎢酸（0.2%，PTA）中，對(duì)噬菌體染色10s.用干凈的濾紙片吸去多余的PTA染色液后，將干燥后的銅網(wǎng)用透射電子顯微鏡（JEM-1400,JEOL）進(jìn)行噬菌體的電鏡觀察。
1.2.3噬菌體的效價(jià)（滴度）測(cè)定噬菌體效價(jià)是指每毫升樣品中含有具有侵染活性的噬菌體粒子數(shù)，又稱(chēng)噬菌斑形成單位數(shù)（plaque-forming unit,PFU）。噬菌體的效價(jià)參照Gu等的方法進(jìn)行：將純化后的噬菌體用SM緩沖液做10倍連續(xù)稀釋后，每個(gè)稀釋度取100μL,分別加入到含有200μL根瘤菌宿主液的試管中，采用雙層瓊脂平板培養(yǎng)法培養(yǎng)噬菌體，計(jì)算噬菌斑個(gè)數(shù)。試驗(yàn)做3次重復(fù)，噬菌體效價(jià)的計(jì)算取其平均值。選取30——300個(gè)噬菌斑的平板用以計(jì)算每毫升未稀釋原液的噬菌體數(shù)（噬菌體效價(jià)）。噬菌體效價(jià)（PFU·mL-1）=平板上的噬菌斑數(shù)/所取樣品體積x稀釋倍數(shù)。
1.2.4噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定噬菌體在感染初期時(shí)，顆粒數(shù)與潛在的細(xì)菌宿主細(xì)胞數(shù)目的比值即為MOI感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection,MOI）。參考Lu等研究方法進(jìn)行根瘤菌噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定，按照不同的噬菌體稀釋比例（100、10、1、0.1、0.01和0.001）與生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的根瘤菌混勻后，靜置20min，室溫下200r·min-1振蕩培養(yǎng)4h,10000xg4℃離心20min后，上清懸液過(guò)0.22μm濾膜。取過(guò)濾的噬菌體液采用雙層平板法測(cè)定其滴度，試驗(yàn)重復(fù)4次，取平均值計(jì)算噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)。
1.2.5噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線參考Weiss等的方法進(jìn)行噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的根瘤菌宿主菌按照相應(yīng)的最佳感染復(fù)數(shù)比例與噬菌體混合，室溫條件下培養(yǎng)30min，12000 r·min-1離心30s后棄掉上清液，用預(yù)先配置好的YMA液體培養(yǎng)基連續(xù)洗滌菌體沉淀2次，隨即利用5mL液體的YMA培養(yǎng)基懸起沉淀后混勻，迅速放入搖床中28℃進(jìn)行震蕩培養(yǎng)，從放置起開(kāi)始計(jì)時(shí)，每間隔10min取出100μL混合液，進(jìn)行倍比稀釋后，按照1.2.3的方法進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，根瘤菌噬菌體效價(jià)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一步生長(zhǎng)曲線的繪制，用以計(jì)算噬菌體的潛伏期、裂解期和裂解量等生物學(xué)特性，其中裂解量的計(jì)算公式為：裂解量=裂解末期噬菌體效價(jià)/感染初期宿主菌濃度。
1.2.6噬菌體對(duì)溫度、pH和紫外光敏感性測(cè)定參考Ji等研究方法進(jìn)行噬菌體熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性的測(cè)定，取噬菌體液1.0mL于無(wú)菌EP管中，分別于不同溫度（30、40、50、60、70和80℃）下水浴1h,之后取出并立即置于冰浴中冷卻，測(cè)定其在不同溫度條件下的效價(jià)。
pH穩(wěn)定性測(cè)試步驟為：取20μL的噬菌體原液，加入到0.98mL的YMA液體培養(yǎng)基中，在28℃條件下孵育1h.將混合物的pH值用不同緩沖液調(diào)至pH3.0——11.0.所用到的緩沖溶液主要包括：50 mmol·L-1檸檬酸緩沖（pH3.0——5.0）、磷酸鹽緩沖液（pH6.0——8.0）、Tris-鹽酸緩沖液（pH9.0）和碳酸緩沖液（pH10.0——11.0），按照1.2.3的方法進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)樣本。
噬菌體對(duì)紫外光敏感性測(cè)定方法：取15mL噬菌體原液于直徑6cm的滅菌培養(yǎng)皿中，置于紫外燈（20W,30cm）下，分別處理0、3、6、9、12、15、18和21min,每次取樣1mL,然后靜置在暗處30min,按照1.2.3的方法測(cè)定其效價(jià)，并計(jì)算其存活率。
1.3數(shù)據(jù)處理
采用Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Sigma Plot12.5進(jìn)行繪圖。
2結(jié)果與分析
2.1根瘤菌噬菌體的分離與純化及形態(tài)學(xué)鑒定
本研究以慢生根瘤菌（USDA110T）、中華根瘤菌（CCBAU05684T）和中華苜蓿根瘤菌（USDA1002T）為宿主，采用雙層平板法，分離獲得9株根瘤菌噬菌體，其噬菌斑均呈圓形分布、表面清晰透明、邊緣光滑平整、沒(méi)有同心圓噬菌斑的現(xiàn)象（圖1）。通過(guò)噬菌斑特征鑒定，9株噬菌體均為裂性噬菌體。依據(jù)不同宿主分別命名為SMM-1、SMM-2、SMM-3、SSS-1、SSS-2、SSS-3和BDM-1、BDM-2、BDM-3.純化后的噬菌體經(jīng)負(fù)染后，電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)及噬菌體特征如圖1所示。獲得的3株苜蓿根瘤菌噬菌體（SMM）和3株慢生型根瘤菌噬菌體（BDM）均為蝌蚪狀，頭部呈二十面體立體結(jié)構(gòu)，帶有可伸縮無(wú)彎曲的長(zhǎng)尾。其頭部大小范圍為（71±8）——（86±5）nm,尾部大小在（86±5）——（111±7）nm范圍內(nèi)（表1）。而中華根瘤菌噬菌體（SSS）頭部形態(tài)近乎于球形，尾部為一個(gè)非伸縮性且可彎曲的長(zhǎng)尾。其頭部直徑明顯小于SMM和BDM,僅為（59±3）——（68±100）nm,而尾部長(zhǎng)度為（208±15）——（236±25）nm,顯著高于SMM和BDM噬菌體。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)制定的分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，9株噬菌體都屬于有尾噬菌體目（Caudovirales），其中SMM和BDM屬于肌尾噬菌體科（Myoviridae），而SSS屬于長(zhǎng)尾噬菌體科（Siphovi-rideae）。
2.2根瘤菌噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)
獲得的噬菌體與相應(yīng)的根瘤宿主菌懸液按照不同稀釋比例混合后，9株噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)分析結(jié)果顯示，SMM-1、SMM-2、SMM-3噬菌體和宿主菌懸液比值在0.1、0.01、0.001時(shí)的滴度達(dá)到最大值，分別為6.3x1010、9.6x1011和3.9x1011 PFU·mL-1;SSS-1、SSS-2、SSS-3分別在0.1、1和0.01的比例時(shí)其滴度達(dá)到最大值，分別為2.6x1010、9.5x 10°和3.6x1010°PFU·mL-1;而B(niǎo)DM-1、BDM-2、BDM-3分在0.1、0.01和1的比例時(shí)滴度達(dá)到最大值，分別為5.1x1011、3.5x1011和7.2x1011PFU·mL-1.研究發(fā)現(xiàn)，侵染相同宿主的噬菌體滴度達(dá)到最大時(shí)的最佳感染復(fù)數(shù)不同。
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