2.2 LL@Fe-TA@mGN 的生長(zhǎng)曲線測(cè)定
為了排除mGN 包埋抑制LL 生長(zhǎng)的可能性，對(duì)比了12 h 內(nèi)LL@Fe-TA@mGN 與未包埋的LL的生長(zhǎng)曲線。由圖3 可知，mGN 包埋未影響LL 的生長(zhǎng)，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。
圖3 LL 與LL@Fe-TA@mGN 的生長(zhǎng)曲線
2.3 LL@Fe-TA@mGN 的微觀形態(tài)分析
通過SEM 與TEM 表征可以觀察到包埋前、后的LL 形態(tài)。從圖4 可以發(fā)現(xiàn)，未包埋的LL 表面光滑，而包埋后的LL 結(jié)構(gòu)完整，表面粗糙，且沒有LL 暴露在外面。這一結(jié)果說明通過金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的橋聯(lián)作用，可將mGN 作為壁材有效地包埋單個(gè)LL。TEM 分析結(jié)果也證明了mGN 被黏附在單個(gè)LL 的表面。此外，SEM 與TEM 分析結(jié)果表明，包埋后的LL 粒徑會(huì)發(fā)生顯著變化。
圖4 LL（a）與LL@Fe-TA@mGN（b）的SEM圖（×30k）
圖5 LL（a）與LL@Fe-TA@mGN（b）的TEM圖（×30k）
2.4 LL@Fe-TA@mGN 的胃液與膽鹽耐受性研究
益生菌對(duì)胃液是非常敏感的。在通過胃部環(huán)境的時(shí)候，益生菌常因受到強(qiáng)酸（pH≤2.5）的影響而失活，因此增強(qiáng)益生菌在胃部環(huán)境的抗性是其發(fā)揮生物活性的前提。如圖6 所示，未包埋的LL在模擬胃液（SGF）的環(huán)境下孵育0.5 h，存活率降至39.35%；孵育1 h 后，存活率為13.00%；孵育2 h 后，LL 基本全部死亡，存活率僅有0.71%。而包埋過的LL 存活率始終高于未包埋的LL，且存在顯著性差異。LL@Fe-TA@mGN 在SGF 環(huán)境下孵育0.5 h 的存活率高達(dá)68.60%，孵育1 h 后存活率變?yōu)?1.79%。即使在孵育2 h 后，益生菌的存活率仍然有10.39%，是未包埋益生菌存活率的14.63倍。該結(jié)果表明，經(jīng)mGN 包埋后LL 抵抗胃液的能力顯著提升。
圖6 LL 與LL@Fe-TA@mGN 暴露在模擬胃液（pH 2.5）中的存活率
注：*.P ＜0.05。
人們?cè)跀z入食物時(shí)，十二指腸會(huì)分泌荷爾蒙，從而刺激膽囊收縮。膽汁在膽囊收縮的影響下通過膽管進(jìn)入腸道。膽鹽承擔(dān)了膽汁的主要消化功能，由于膽鹽在人體中易形成膠束，且腸道-肝臟循環(huán)系統(tǒng)的存在，使得每個(gè)膽鹽分子在消化階段能夠被重復(fù)利用多次，這極大地影響了益生菌的活性。因此為了能夠以一定的數(shù)量定殖于腸道并發(fā)揮生物活性，益生菌還需要抵抗膽鹽的降解。由圖7 可知，包埋后的LL 抵抗膽鹽的能力顯著提升，即使在膽鹽中孵育2 h，活菌數(shù)量仍然有42.66%，相對(duì)于未包埋的LL 的存活率（22.01%）具有顯著性差異。以上結(jié)果表明，mGN 賦予了LL較好的抗膽鹽性能。
圖7 LL 與LL@Fe-TA@mGN 暴露在膽鹽中的存活率
注：*.P ＜0.05；**.P ＜0.01。
2.5 LL@Fe-TA@mGN 的體內(nèi)滯留成像
腸道蠕動(dòng)加速了益生菌的排泄。減緩益生菌被排出體外的速度有利于益生菌在腸道的定殖。mGN 作為一種益生元，可被腸道中的腸道菌群代謝形成短鏈脂肪酸。隨著最外層mGN 的破壞，F(xiàn)e-TA 結(jié)構(gòu)隨之暴露。鑒于金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)較強(qiáng)的黏附能力，進(jìn)一步探究了LL@Fe-TA@mGN 在體內(nèi)的滯留能力。使用Cy5 對(duì)LL 進(jìn)行標(biāo)記，并構(gòu)建Cy5 標(biāo)記的LL@Fe-TA@mGN。用標(biāo)記后的LL 或者LL@Fe-TA@mGN 灌胃小鼠，分別在4 h和8 h 后進(jìn)行活體成像，結(jié)果如圖8 所示。由圖8可知，給藥4 h 后，被灌胃LL 組的小鼠的體內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著弱于灌胃LL@Fe-TA@mGN 的小鼠，說明LL 被大量的代謝排出體外。即使在灌胃8 h后，LL@Fe-TA@mGN 在小鼠體內(nèi)仍然保持較高的益生菌數(shù)量，而LL 基本被排出體外。以上結(jié)果表明，LL@Fe-TA@mGN 具有更好的體內(nèi)滯留能力。
圖8 小鼠灌胃Cy-5 標(biāo)記的LL 或者LL@Fe-TA@mGN 后的體內(nèi)成像
3 結(jié)論
本文以羧甲基化β-葡聚糖為壁材，通過金屬-酚醛網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的橋聯(lián)作用，可實(shí)現(xiàn)對(duì)單個(gè)乳酸乳球菌的完整包埋。這種包埋方法簡(jiǎn)單、快速，在不改變?nèi)樗崛榍蚓陨斫Y(jié)構(gòu)的情況下，可顯著提升乳酸乳球菌的抗胃液與抗膽鹽能力，并延長(zhǎng)其在體內(nèi)的滯留，從而幫助乳酸乳球菌在體內(nèi)更好地繁殖。研究結(jié)果為乳酸乳球菌包埋體系的構(gòu)建提供了新思路，并為提高乳酸乳球菌在胃腸道的活性提供了理論依據(jù)。
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