海洋環(huán)境是生物產(chǎn)生新型生物活性化合物和有趣蛋白質(zhì)的來(lái)源。海洋細(xì)菌引起了人們的廣泛關(guān)注，但近年來(lái)隨著對(duì)海洋真菌的分離和收集的增加，人們對(duì)海洋真菌的興趣也有所增長(zhǎng)。篩選新化合物通常涉及在有限條件下培養(yǎng)的大量生物，或在包括脅迫在內(nèi)的更廣泛條件下培養(yǎng)的幾種生物。微量滴定板和相關(guān)自動(dòng)化工具的開(kāi)發(fā)極大地促進(jìn)了單細(xì)胞酵母和細(xì)菌生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)的獲取。微量滴定板中的生長(zhǎng)通常以光密度測(cè)量。微量滴定板很少用于獲得絲狀真菌的動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，絲狀真菌可能無(wú)法在孔中均勻生長(zhǎng)。絲狀真菌生長(zhǎng)為分支菌絲體，分裂時(shí)無(wú)細(xì)胞分離。不過(guò)有研究人員證明光密度為真菌作為分散菌絲生長(zhǎng)的菌株提供了一種有意義的生長(zhǎng)測(cè)量方法。通過(guò)在測(cè)量中增加均化步驟，擴(kuò)大了光密度的使用范圍，以監(jiān)測(cè)絲狀真菌的生長(zhǎng)，并指出碎裂程度會(huì)影響光密度與細(xì)胞干生物量之間的關(guān)系。相關(guān)發(fā)現(xiàn)，在評(píng)估許多海洋真菌的生長(zhǎng)時(shí)，光密度測(cè)量比顯微鏡方法更實(shí)用。
本論文研究人員使用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中100孔蜂窩平板培養(yǎng)和在自動(dòng)培養(yǎng)箱中對(duì)96孔酶標(biāo)板培養(yǎng)進(jìn)行比較，以評(píng)估從海洋環(huán)境中分離出的幾種絲狀真菌在四種潛在碳源（葡萄糖，木糖，半乳糖和甘油）上的生長(zhǎng)。該研究將為菌株評(píng)估提供一致的動(dòng)力學(xué)增長(zhǎng)數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)可用于指導(dǎo)目標(biāo)菌株的工藝放大。
Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用
使用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀對(duì)真菌微生物進(jìn)行培養(yǎng)，在含有290μl培養(yǎng)基的100孔蜂窩板2板（孔深14 mm，孔直徑頂部7 mm）中進(jìn)行培養(yǎng)。以10μl微生物為接種物，為孢子形成菌株提供的最終分生孢子濃度為每毫升1至6 x 10 4分生孢子。P.chrysogenum KF657是一個(gè)例外，每毫升接種4 x 105分生孢子。將A.cruciatus LF680菌絲勻漿稀釋15倍于水，10μl作為接種物。以冰凍菌絲懸液接種varia KF560。接種前將冷凍懸浮液稀釋30倍，將轉(zhuǎn)移的甘油減少到0.22 g-1，接種物中的葡萄糖和蛋白胨對(duì)培養(yǎng)井的貢獻(xiàn)小于22 mg-1。將100孔蜂窩板在24°C下以中等速度和最大振幅（頻率為10 Hz，以線性提供600 rpm轉(zhuǎn)速而不是軌道運(yùn)動(dòng)）連續(xù)搖動(dòng)孵育。每隔30分鐘在600 nm處測(cè)量光密度（OD）長(zhǎng)達(dá)10天。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：八種海洋真菌的能夠在BioScreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀或自動(dòng)化培養(yǎng)箱中的四種底物上生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)海洋真菌菌株在Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀比在自動(dòng)化培養(yǎng)箱生長(zhǎng)得更好，復(fù)制也更相似。自動(dòng)化培養(yǎng)箱中復(fù)制品之間的高度差異意味著通常只能（統(tǒng)計(jì)上）區(qū)分生長(zhǎng)與不生長(zhǎng)之間的差異，而無(wú)法區(qū)分菌株在木糖，葡萄糖或半乳糖上是否生長(zhǎng)得更好。由于復(fù)制品在Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中比在自動(dòng)化培養(yǎng)箱中顯示出更少的變異，濕度控制和搖動(dòng)的差異可能是造成Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀和自動(dòng)化培養(yǎng)箱生長(zhǎng)差異的原因。與Bioscreen C中相比，在自動(dòng)化培養(yǎng)箱中使用的96孔標(biāo)準(zhǔn)酶標(biāo)板中生長(zhǎng)時(shí)，菌絲體更可能聚集為沉淀物。在自動(dòng)化培養(yǎng)箱中使用的96孔酶標(biāo)板中培養(yǎng)物的大誤差條（相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)誤差為10–30％，有時(shí)更高）中可以看到重復(fù)之間的差異。相比之下，Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀使用的100孔蜂窩平板的生長(zhǎng)大部分分散，各孔之間具有良好的重現(xiàn)性。自動(dòng)化培養(yǎng)箱中使用的96孔酶標(biāo)板中培養(yǎng)物還受到96孔板蓋子上的凝結(jié)的影響，并從板邊緣的孔中蒸發(fā)出液體，導(dǎo)致在96孔酶標(biāo)板的孔邊緣產(chǎn)生了比實(shí)際更高OD值，特別是在使用固定相培養(yǎng)基的環(huán)境下。在所有條件下，所有菌株均觀察到較長(zhǎng)的滯后階段（30–100小時(shí)），通常在自動(dòng)化培養(yǎng)箱中的培養(yǎng)要比在Bioscreen C中更長(zhǎng)。
圖1、接種物中甘油和分生孢子濃度的對(duì)比生長(zhǎng)速率，最大OD和近似滯后時(shí)間的測(cè)量的影響。產(chǎn)黃青霉LF654菌絲體在Bioscreen C的100孔板中以300μL培養(yǎng)液在pH值為4.25的緩沖液中（帶有實(shí)心符號(hào)）或不添加（空心符號(hào)）葡萄糖（2 g L-1）的緩沖液中生長(zhǎng)。
圖2、A）P.chrysogenum KF657，B）D.salina LF304，C）H.varia KF560，D）A.cruciatus LF680，E）Tritiracium sp.。LF562，F(xiàn)）P.pinophilum LF458，G）M.brevicaulis LF580和H）Calcarisporiumsp.KF525的光密度值。菌絲體在pH值為4.25的特定培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，其中葡萄糖（紅色），木糖（藍(lán)色），半乳糖（青色）或甘油（綠色）作為碳源，或在100孔中300μl培養(yǎng)物中不添加碳源（灰色）Bioscreen C（1）中的微孔板或自動(dòng)化培養(yǎng)箱（2）中96孔板（酶標(biāo)板）中的150μl培養(yǎng)物。
圖3.P.chrysogenum KF657的光密度。在以葡萄糖，木糖，半乳糖或甘油為碳源，在pH 4.25緩沖的特定培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的，在自動(dòng)化培養(yǎng)箱的96孔酶標(biāo)板中以150μl培養(yǎng)物（在大圖中）或在Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的100孔板中以300μl體積的培養(yǎng)物（小圖）。96孔板中的邊緣孔（灰色）分別表示為P1 S2，P1 S3，P1 S5和P1 S4，以及100孔板中的111、112、141和131孔。
圖4、在微量滴定板上培養(yǎng)的海洋真菌的最大OD值
圖5、在微量滴定板上培養(yǎng)的海洋真菌的比生長(zhǎng)率（h-1）。
總結(jié):本論文使用Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀中100孔蜂窩平板培養(yǎng)和在自動(dòng)化培養(yǎng)箱中對(duì)96孔酶標(biāo)板培養(yǎng)進(jìn)行比較，以評(píng)估從海洋環(huán)境中分離出的幾種絲狀真菌在四種潛在碳源（葡萄糖，木糖，半乳糖和甘油）上的生長(zhǎng)。各種海洋真菌可產(chǎn)生有趣的生物活性化合物，但要擴(kuò)大這些化合物的產(chǎn)量可能具有挑戰(zhàn)性，特別是因?yàn)橥ǔ?duì)生產(chǎn)生物體如何生長(zhǎng)知之甚少。研究人員評(píng)估了使用了Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的100孔蜂窩板或自動(dòng)化培養(yǎng)箱和96孔酶標(biāo)板板對(duì)8種絲狀海洋真菌，6種孢子形成和2種非孢子形成的適宜性進(jìn)行培養(yǎng)研究，高通量獲取生長(zhǎng)和底物(葡萄糖、木糖、半乳糖或甘油)利用的數(shù)據(jù)。在這兩個(gè)培養(yǎng)系統(tǒng)中，所有八種真菌均能生長(zhǎng)，但與Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)試的數(shù)據(jù)相比，自動(dòng)化培養(yǎng)箱獲得的數(shù)據(jù)生長(zhǎng)更易變，且噪聲更大。而在Bioscreen C中生長(zhǎng)的菌株的特定生長(zhǎng)率在0.01(不添加底物)到0.07 h-1之間，在自動(dòng)化培養(yǎng)箱中的96孔板中（常規(guī)酶標(biāo)板）生長(zhǎng)的菌株在0.01到0.27 h-1之間。Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀和自動(dòng)化培養(yǎng)箱這兩個(gè)系統(tǒng)都可以提供絲狀真菌的生理數(shù)，但是，由于來(lái)自動(dòng)化培養(yǎng)箱中的96孔板中（常規(guī)酶標(biāo)板）的數(shù)據(jù)中存在噪音，從自動(dòng)化培養(yǎng)箱中的96孔板中（常規(guī)酶標(biāo)板）獲得的數(shù)據(jù)只能用于區(qū)分支持或不支持生長(zhǎng)的底物，而B(niǎo)ioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀得到的數(shù)據(jù)還提供了有關(guān)底物偏好的信息。
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