2.3噬菌體PJNB028系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析
基于全基因組序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)顯示(圖3)，與噬菌體PJNB028關(guān)系最近的是枯草芽孢桿菌噬菌體2S-4，這16株噬菌體均屬于Caudoviricetes綱，其中3株屬于Tsamsavirus屬、1株屬于Haetaevirus屬、2株屬于Spbetavirus屬、1株屬于Zhangjivirus屬、9株未分類(lèi)?；谀┒舜髞喕鞍踪|(zhì)序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示(圖4)，與噬菌體PJNB028關(guān)系最近的是枯草芽孢桿菌噬菌體PK-3，13株噬菌體均屬于Caudoviricetes綱，其中2株屬于Tsamsavirus屬、1株屬于Natevirus屬、2株屬于Spbetavirus屬、1株屬于Kirovvirus屬、1株屬于Haetaevirus屬、1株屬于Kenyattavirus屬、5株未分類(lèi)。
圖3噬菌體PJNB028全基因組進(jìn)化樹(shù)
圖4噬菌體PJNB028末端酶大亞基系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)
2.4噬菌體PJNB028最佳MOI測(cè)定
如圖5所示，MOI為1時(shí)，噬菌體PJNB028的效價(jià)最高，達(dá)到4.5×108 PFU/mL。
圖5噬菌體PJNB028最佳MOI測(cè)定
2.5噬菌體PJNB028一步生長(zhǎng)曲線
如圖6所示，噬菌體PJNB028潛伏期為10 min，10~80 min效價(jià)開(kāi)始明顯上升，裂解期為60 min。爆發(fā)量為291 PFU/cell。
圖6噬菌體PJNB028的一步生長(zhǎng)曲線
2.6噬菌體PJNB028的溫度穩(wěn)定性測(cè)定
噬菌體在37~60℃環(huán)境下效價(jià)穩(wěn)定。在70℃下孵育30 min，噬菌體效價(jià)由4×109 PFU/mL降至6.7×107 PFU/mL，孵育60 min降至8.17×106 PFU/mL;在80℃下孵育30 min，噬菌體效價(jià)從4×109 PFU/mL降至6.1×104 PFU/mL，孵育60 min降至3.33×102 PFU/mL，在90℃孵育30 min后，噬菌體活性完全喪失(圖7)。
圖7噬菌體PJNB028熱穩(wěn)定性
2.7噬菌體PJNB028的pH穩(wěn)定性測(cè)定
如圖8所示，噬菌體PJNB028在pH為3~11的緩沖液中處理1 h效價(jià)無(wú)明顯變化，在pH>2和pH<12時(shí)完全失活。
圖8噬菌體PJNB028的pH穩(wěn)定性
2.8噬菌體PJNB028紫外線敏感性測(cè)定
如圖9所示，噬菌體PJNB028在紫外燈照射下效價(jià)逐漸降低，效價(jià)從1.5×109 PFU/mL降低為1.36×104 PFU/mL，表明噬菌體PJNB028對(duì)紫外線較敏感。
圖9噬菌體PJNB028紫外線照射穩(wěn)定性
2.9噬菌體PJNB028體外抑菌效果測(cè)定
如圖10所示，當(dāng)MOI為0.001~10時(shí)，不同濃度噬菌體均能對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)起到一定抑制作用，抑制時(shí)間在1~8 h，當(dāng)MOI為1時(shí)對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制效果最好。
圖10噬菌體PJNB028的體外抑菌效果測(cè)定
2.10噬菌體PJNB028裂解譜測(cè)定
如表2所示，噬菌體PJNB028對(duì)5株莫哈韋芽孢桿菌、5株枯草芽孢桿菌具有裂解性，對(duì)其余8株枯草芽孢桿菌、1株蠟樣芽孢桿菌和1株地衣芽孢桿菌無(wú)裂解性。
表2噬菌體PJNB028宿主譜
注:+表示裂解，-表示不裂解
2.11抗性菌株篩選
使用宿主菌(圖11A)篩選到3株不能裂解的抗性菌株(圖11B)，如圖11C所示，對(duì)數(shù)期的宿主菌和抗性菌與噬菌體共培養(yǎng)5 h后，宿主菌變澄清，抗性菌與噬菌體雙層板未見(jiàn)到噬菌斑(圖11D)。在顯微鏡下觀察，被噬菌體裂解的宿主菌體明顯稀少(圖11F)，而抗性菌株菌體未發(fā)現(xiàn)明顯變化。
圖11宿主菌與抗噬菌體菌株的比較
A:宿主菌株菌落形態(tài)B:抗噬菌體突變菌株菌落形態(tài)C:加入噬菌體共培養(yǎng)5 h后菌液對(duì)比，左為宿主菌，右為抗性菌株D:抗性菌株與噬菌體雙層平板結(jié)果E:宿主菌對(duì)數(shù)期菌液形態(tài)F:對(duì)數(shù)期宿主菌加入噬菌體共培養(yǎng)5 h后菌液形態(tài)G:抗性菌株對(duì)數(shù)期菌液形態(tài)H:對(duì)數(shù)期抗性菌株加入噬菌體共培養(yǎng)5 h后菌落形態(tài)
2.12菌體生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)
經(jīng)48 h發(fā)酵培養(yǎng)監(jiān)測(cè)顯示(圖12)，野生型菌株T0與突變株T1和T3的OD600值呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，而T2的生長(zhǎng)速率較緩。
圖12發(fā)酵菌株生長(zhǎng)曲線
2.13菌液效價(jià)隨時(shí)間的變化
如圖13所示，抗性突變株T1和T3的效價(jià)表現(xiàn)更優(yōu):發(fā)酵24 h時(shí)，T3效價(jià)為(8.9±0.1)Lg(CFU/mL)，顯著高于野生型T0;而T2在發(fā)酵24 h和36 h時(shí)的效價(jià)均顯著低于T0。不同突變菌株的生長(zhǎng)特征不同，有的優(yōu)于野生型，有的比野生型菌株弱。
圖13發(fā)酵菌株效價(jià)變化
2.14淀粉酶活性分析
在發(fā)酵過(guò)程中，T0和T3的酶活在24 h達(dá)到峰值，隨后顯著下降，如圖14所示。值得注意的是，菌株T2呈現(xiàn)出獨(dú)特的持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，其酶活在48 h內(nèi)從12 h的(168±1)μg/(min·mL)呈線性上升至(452±1)μg/(min·mL)。此外，菌株T3在24 h時(shí)的酶活水平顯著高于其他突變株。不同時(shí)間段菌株產(chǎn)生的淀粉酶活性不同，菌株的代謝能力不同。
圖14α-淀粉酶活性動(dòng)態(tài)變化
3討論
本研究從高溫堆肥中分離純化出一株枯草芽孢桿菌噬菌體PJNB028，可以在枯草芽孢桿菌上形成2 mm完全透亮的噬菌斑，噬菌斑周?chē)袝灜h(huán)，隨著孵育時(shí)間增加，暈環(huán)也逐漸增大，推測(cè)該噬菌體可能分泌噬菌體衍射酶。
根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析PJNB028噬菌體屬于Caudoviricetes綱，與2S-4、PK-3最近，與16株噬菌體同源性較高，表明這些噬菌體都是潛在的已經(jīng)分離到的污染源，PJNB028具有代表意義。該噬菌體的最佳MOI為1，增殖潛伏期為10 min，爆發(fā)期為70 min，爆發(fā)量為291 PFU/cell，基因組大小為162 308 bp，含有237個(gè)ORF。通過(guò)全基因組分析和生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物學(xué)特性，屬于枯草芽孢桿菌噬菌體的優(yōu)勢(shì)噬菌體。
噬菌體PJNB028基因組中有2個(gè)tRNA基因與Arg(細(xì)菌精氨酸)稀有密碼子對(duì)應(yīng)，攜帶tRNA的噬菌體能夠減少對(duì)宿主菌tRNA的依賴，一定程度上增強(qiáng)裂解能力從而擴(kuò)大裂解譜范圍。噬菌體受體結(jié)合蛋白(RBPs)是決定噬菌體裂解譜的一個(gè)關(guān)鍵因素，噬菌體可通過(guò)ORF138尾釘?shù)鞍?tail spike proteins，TSPs)上的RBPs吸附在宿主菌表面進(jìn)行裂解，有研究表明RBP可作為熒光納米探針識(shí)別宿主細(xì)菌。ORF208毒素-抗毒素(toxin-antitoxin，TA)系統(tǒng)是原核生物重要免疫系統(tǒng)之一，在細(xì)菌抵抗噬菌體防御機(jī)制中占有主導(dǎo)作用。噬菌體在與TA系統(tǒng)協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中進(jìn)化出對(duì)TA系統(tǒng)的防御，并且噬菌體可利用細(xì)菌的毒素-抗毒素系統(tǒng)控制裂解或溶原的狀態(tài)。
噬菌體PJNB028較耐高溫，在80℃處理1 h效價(jià)明顯降低，說(shuō)明通過(guò)高溫可減少噬菌體的污染。Krasowska等分離的枯草芽孢桿菌噬菌體耐高溫，在121℃條件下孵育1 min仍保持感染活性，一般認(rèn)為Myoviridae和Siphoviridae家族成員對(duì)較大溫度波動(dòng)具有抵抗力。在紫外線照射下，噬菌體的效價(jià)降低較緩慢，表明該噬菌體對(duì)野外紫外線較耐受，而趙欣卓等分離的枯草芽孢桿菌噬菌體Bac-S在紫外線下21 min完全失活。噬菌體PJNB028在pH為3~11時(shí)效價(jià)穩(wěn)定，耐酸不耐堿，可以熱堿液消滅。與一些對(duì)枯草芽孢桿菌的研究結(jié)果不同，Zhang等分離的枯草芽孢桿菌噬菌體phi18耐堿不耐酸(pH 4~12)。
通過(guò)自然選擇或基因工程可以制備抗噬菌體突變體，劉秀俠等為防止噬菌體P260污染，利用自發(fā)突變的方法篩選出一株優(yōu)良的枯草芽孢桿菌突變菌。張建璀通過(guò)自然選育和紫外誘變育種選育的方法，篩選出噬菌體TXp1的抗噬菌體菌株。本研究使用自然突變的方法共培養(yǎng)篩選得到抗性菌株3株，與野生菌株進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)部分菌株在發(fā)酵過(guò)程中表現(xiàn)出更高的α-淀粉酶活性及菌株效價(jià)，為工業(yè)發(fā)酵菌株改良提供了新策略。
4結(jié)論
目前，約60%商用酶是由芽孢桿菌產(chǎn)生的，但在工業(yè)發(fā)酵中噬菌體感染不可避免，同時(shí)，部分枯草芽孢桿菌也是引起食品腐敗、感染的有害細(xì)菌，而枯草芽孢桿菌噬菌體也可能會(huì)在預(yù)防食品腐敗和其他醫(yī)療方面有用途。本文分離的枯草芽孢桿菌裂解性噬菌體PJNB028屬于Caudoviricetes綱，具有較寬裂解譜，通過(guò)噬菌體與宿主菌共培養(yǎng)篩選到3株抗菌菌株;配合高溫蒸汽、熱堿液可以徹底消毒。從有益芽孢桿菌和致病芽孢桿菌防治兩方面看，進(jìn)一步建立枯草芽孢桿菌及其噬菌體資源庫(kù)、共進(jìn)化培養(yǎng)及基因編輯平臺(tái)具有巨大的需求和應(yīng)用潛力。
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