本文對(duì)普遍采用的四爿藻生物量累積時(shí)期生長(zhǎng)狀況的評(píng)價(jià)方法進(jìn)行比較，旨在尋找適合于評(píng)價(jià)四爿藻生活史運(yùn)動(dòng)時(shí)期細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快捷的方法。
1、實(shí)驗(yàn)
1.1材料
實(shí)驗(yàn)所用藻種為3個(gè)不同種的海洋四爿藻：朱氏四爿藻(TetraselmischuiWH01)、心形四爿藻(T.cordiformisWH02)，采自山東省青島市沿海地區(qū)；大四爿藻(T.helgolandicaWH03)，采自浙江省象山縣。藻種由中科院武漢植物研究所藻種庫(kù)提供。
1.2四爿藻的培養(yǎng)
將3種四爿藻藻種接種于改良的適合于水產(chǎn)養(yǎng)殖的四爿藻培養(yǎng)基中，置于RH-150-G型恒溫光照培養(yǎng)箱中(20±2)℃下持續(xù)光照培養(yǎng)，光強(qiáng)2000～4000 lx，搖床轉(zhuǎn)速120 r·min-1。
1.3四爿藻的生長(zhǎng)評(píng)價(jià)
1.3.1細(xì)胞計(jì)數(shù)
分別取待測(cè)的四爿藻培養(yǎng)物(培養(yǎng)前6 d)，用Lugol氏固定液固定，血球計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)。每樣品重復(fù)4次，求平均值，繪制生長(zhǎng)曲線。
1.3.2葉綠素含量測(cè)定
采用快速微量提取法進(jìn)行，略作改動(dòng)。離心收獲不同生長(zhǎng)期的四爿藻培養(yǎng)物，加入95%乙醇研磨(補(bǔ)足體積)后室溫下抽提4～6 h，離心取上清，乙醇重提，直至抽提充分(共抽提3次)。合并上清，用722型分光光度計(jì)檢測(cè)OD649和OD665值。根據(jù)下面公式計(jì)算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)的含量(μg·mL-1)，每樣品重復(fù)4次，求平均值，繪制生長(zhǎng)曲線并與細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行比較。
Chl a含量=13.7×OD665-5.76×OD649
Chl b含量=25.8×OD649-7.6×OD665
1.3.3特定光密度值測(cè)定
采用722型分光光度計(jì)直接測(cè)定四爿藻培養(yǎng)物在不同波長(zhǎng)(560 nm、625 nm、750 nm)下的光密度值，繪制生長(zhǎng)曲線，并與細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行比較。
1.3.4數(shù)據(jù)處理及分析
采用Origin v6.0作圖，分析生長(zhǎng)曲線的差異，并對(duì)3種四爿藻據(jù)葉綠素a的平均含量繪制的生長(zhǎng)曲線進(jìn)行回歸，并與細(xì)胞計(jì)數(shù)法得到的生長(zhǎng)曲線回歸結(jié)果進(jìn)行比較。
圖1朱氏四爿藻(A)、心形四爿藻(B)、大四爿藻(C)的生長(zhǎng)曲線(根據(jù)幾組特定光密度值繪制)
圖2朱氏四爿藻(A)、心形四爿藻(B)、大四爿藻(C)的生長(zhǎng)曲線(根據(jù)葉綠素a、b含量繪制)
結(jié)論
通過測(cè)定3種四爿藻的細(xì)胞數(shù)目、葉綠素a和葉綠素b的含量變化及幾種波長(zhǎng)下的特征光密度吸收值，分別繪制生長(zhǎng)曲線。結(jié)果表明，葉綠素b含量變化和OD560、OD625、OD750變化與生長(zhǎng)趨勢(shì)不太吻合，而葉綠素a含量變化和細(xì)胞數(shù)目變化較為一致，呈現(xiàn)較為規(guī)則的指數(shù)生長(zhǎng)曲線。表明了利用葉綠素a含量變化可評(píng)價(jià)四爿藻生長(zhǎng)狀況。此外，葉綠素a含量測(cè)定方法較為直接，只需取少量細(xì)胞(1 mL即可)經(jīng)過乙醇簡(jiǎn)單抽提，再測(cè)定光密度值，方法簡(jiǎn)便、快捷，較適合大規(guī)模海產(chǎn)養(yǎng)殖的需求。
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