草魚(Ctenopharyngodon idellus)屬鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬，一種草食性魚類，飼養(yǎng)成本低，養(yǎng)殖地域廣，是我國淡水養(yǎng)殖的重要品種，除新疆，青藏高原外，在我國各地均有養(yǎng)殖，也是廣東省的淡水主養(yǎng)品種之一。但是草魚養(yǎng)殖期間易發(fā)生病害問題，其中以病毒性出血病最甚，對我國草魚養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失。草魚呼腸孤病毒(Grass carpreovims，GCRV)感染導(dǎo)致的草魚出血病已經(jīng)成為制約草魚產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要因素之一。目前，對于草魚出血病的防治，還沒有特異有效的治療藥物和方法，最為有效的辦法仍然是免疫預(yù)防。魚類細胞系正是研究病毒感染途徑、感染機理以及研制病毒疫苗的重要研究體系。因此，建立草魚細胞系，是進行草魚呼腸孤病毒的分離與鑒定，研究其致病機理，疫苗制備和免疫預(yù)防技術(shù)的重要基礎(chǔ)。
迄今為止，雖然有草魚腎臟細胞系(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，左文功，水產(chǎn)學(xué)報，1986,10(1):11-16)、草魚吻端組織細胞株ZC-7901及其亞株ZC-7901S1(浙江省淡水水產(chǎn)研究所，張念慈，水產(chǎn)學(xué)報，1981,5(2)：111-119)吻端成纖維細胞系PSF(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，國家科技成果，2005，S943.112；S941.411)、草魚尾鰭組織二倍體細胞系(中國科學(xué)院水生生物研究所，魏彥章，水生生物學(xué)報，1986,10(3):293-294)、草魚囊胚細胞系、肝細胞系等幾個細胞系的文獻報道，但是仍未見腦細胞系的報道。
草魚腦組織的制備：
鮮活草魚于75％酒精中浸泡1～2min，置于超凈臺中無菌取下腦組織，用PBS漂洗2遍后，置于5ml的無菌青霉素小瓶中(含5％(v/v)胎牛血清的M199培養(yǎng)液)，用手術(shù)剪將其剪成約1mm3
碎塊，加入5ml PBS收集至15ml離心管，1000rpm離心3min，離心收集組織塊后棄去上清，重復(fù)一次。加入組織塊約10倍體積的0.25％胰蛋白酶，37℃消化20min。加入培養(yǎng)液終止消化，用200目尼龍紗網(wǎng)過濾至新的一次性培養(yǎng)皿中，加入5ml細胞培養(yǎng)液沖洗紗網(wǎng)再過濾一次，將濾過液收集至15ml離心管中，離心去上清，收集細胞。紗網(wǎng)上的組織塊可以再重復(fù)消化，過濾。用含20％(v/v)FBS(胎牛血清)的M199培養(yǎng)液充分懸浮細胞，即得到草魚腦細胞懸液，將細胞懸液均勻接種于25cm2的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件為27℃，5％CO2。
草魚腦細胞培養(yǎng)液的配制：
M199培養(yǎng)液(GIBCO)(pH值為7.0～7.4)加入20％(v/v)胎牛血清(Hyclone)。細胞傳至10代以后，胎牛血清添加量減至10％(v/v)。
草魚腦細胞原代培養(yǎng)的啟動：
用細胞培養(yǎng)液懸浮細胞，于27℃，5％CO2中培養(yǎng)；腦細胞遷出后，每隔3～5天換液一次，以去除未貼壁的組織和死細胞；細胞在完全培養(yǎng)液中生長狀態(tài)良好，增殖明顯。
草魚腦細胞的培養(yǎng)條件研究
草魚腦細胞最佳培養(yǎng)基的確定
選擇DMEM、M199、MEM、L-15四種細胞培養(yǎng)基，并添加終濃度為10％(v/v)的FBS制備細胞培養(yǎng)液。調(diào)整細胞密度為4×105個/mL，四種培養(yǎng)基各按2.5mL/孔的量接種于6孔板，于27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1d從每個實驗組里取出3孔細胞，用Trypsin-EDTA消化法收集細胞并計數(shù)，共培養(yǎng)7d，連續(xù)計數(shù)7次，繪制其生長曲線。確定其最適培養(yǎng)基為M199或L-15培養(yǎng)基。
草魚腦細胞最適血清濃度的確定
分別配制FBS濃度為5％、10％、15％、20％(v/v)的培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為4×105個/mL，四種血清濃度培養(yǎng)基各按2.5mL/孔的量接種于6孔板，于27℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1d從每個實驗組里取出3孔細胞，用Trypsin-EDTA消化法收集細胞并計數(shù)，共培養(yǎng)7d，連續(xù)計數(shù)7次，繪制其生長曲線。
草魚腦細胞最適培養(yǎng)溫度的確定
選擇15℃、22℃、27℃、32℃四個不同培養(yǎng)溫度，使用添加10％FBS的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細胞密度為4×105
個/mL，細胞懸液按2.5mL/孔的量接種于6孔板并置于于四個不同培養(yǎng)溫度培養(yǎng)箱里。每1d從每個實驗組里取出3孔細胞，用Trypsin-EDTA消化法收集細胞并計數(shù)，共培養(yǎng)7d，連續(xù)計數(shù)7次，繪制其生長曲線。
草魚腦細胞群體倍增時間測定
取60代細胞接種于六孔板，使其終濃度為4×105細胞/mL，置27℃培養(yǎng)。每隔1d收集3個孔中的培養(yǎng)細胞，混勻后用Countstar細胞計數(shù)儀進行細胞計數(shù)，連續(xù)測定7d。以培養(yǎng)時間(h)為橫坐標(biāo)，細胞濃度(細胞/mL)為縱坐標(biāo)，繪制生長曲線。實驗重復(fù)3次。根據(jù)公式T＝t×lg2/lg(Nt/N0)計算細胞的群體倍增時間，經(jīng)計算第60代CIB群體倍增時間為31.664h，細胞生長狀態(tài)良好。其中，N0為接種細胞數(shù)，Nt為時間t后的細胞數(shù)。
草魚腦細胞對草魚出血病病毒(GCRV)的敏感性：
以第60代草魚腦細胞為對象，檢測草魚出血病病毒(GCRV)對該細胞的敏感程度。密度為4×105個mL-1細胞接種24小時后，將病毒103TCID50/mL溶液加入細胞培養(yǎng)瓶中，1小時后，移去病毒溶液，更換新鮮細胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)，約2天后，觀察到細胞病變效應(yīng)(CPE)后，將細胞做電鏡切片觀察。透射電鏡結(jié)果顯示，在草魚腦細胞系中觀察到大量GCRV病毒粒子。
草魚腦細胞CIB最適培養(yǎng)基為M199培養(yǎng)基，最適胎牛血清濃度為10％，最適生長溫度為27℃，生長曲線正常，可以進行連續(xù)傳代，也可以對其進行冷凍保存。以草魚呼腸孤病毒(GCRV)病毒感染細胞系可以檢測到病毒粒子的存在，證實草魚腦細胞系可以直接應(yīng)用于病毒感染試驗及疫苗研究。同時，該細胞對羅非魚湖病毒TiLV敏感，可用于羅非魚湖病毒病原學(xué)研究及羅非魚湖病毒病防控產(chǎn)品開發(fā)。
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