2結果
2.1重組質粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的分離穩(wěn)定性
重組鈍齒棒桿菌在無卡那霉素抗性選擇壓力的條件下,在LB固體平板上連續(xù)傳代100次,每隔10代次檢測1次質粒丟失情況。實驗結果表明,重組質粒pJL23-cglⅠ在重組鈍齒棒桿菌中未見明顯丟失現(xiàn)象(見表1)。
表1重組質粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的分離穩(wěn)定性
2.2重組質粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的結構穩(wěn)定性
表2重組鈍齒棒桿菌在不同傳代次數(shù)中的噬菌體抗性(EOP)
取傳代次數(shù)分別為原代、20、40、60、80、100次的重組鈍齒棒桿菌進行噬菌體抗性定量檢測,通過噬菌體感染實驗分析cglⅠ基因在傳代過程中是否正常表達,以此考察重組質粒pJL23-cglⅠ在鈍齒棒桿菌中的結構穩(wěn)定性。由表2可以看出,重組鈍齒棒桿菌在傳代過程中一直保持抗噬菌體活性,與原代菌株相比,EOP均小于10-8。表明cglⅠ基因在重組鈍齒棒桿菌株中穩(wěn)定表達,即在傳代培養(yǎng)過程中,重組質粒的結構穩(wěn)定。
2.3重組質粒pJL23-cglⅠ對鈍齒棒桿菌生長的影響
從野生鈍齒棒桿菌和重組鈍齒棒桿菌的生長曲線可以看出(見圖1),在相同培養(yǎng)條件下,野生鈍齒棒桿菌培養(yǎng)到3 h左右便達到對數(shù)生長期,而重組鈍齒棒桿菌達到對數(shù)期的時間約延遲1 h左右,但二者達到穩(wěn)定期的時間趨于相同?？傮w上2個菌株的生長率相差不大,只是重組鈍齒棒桿菌進入對數(shù)期生長速度要略晚于野生鈍齒棒桿菌。
圖1野生鈍齒棒桿菌和重組鈍齒棒桿菌的生長曲線
2.4重組質粒pJL23-cglⅠ對鈍齒棒桿菌產(chǎn)生谷氨酸的影響
由圖2可以看出,重組鈍齒棒桿菌和野生鈍齒棒桿菌在發(fā)酵過程中谷氨酸積累量的變化趨勢基本一致,具有相同的谷氨酸積累高峰,即在發(fā)酵32 h有最大的谷氨酸積累量,分別為277.74 mg/L和261.39 mg/L,表明重組質粒pJL23-cglⅠ的導入并未影響鈍齒棒桿菌的代謝產(chǎn)酸量。
圖2谷氨酸產(chǎn)生動力學曲線
3討論
對重組鈍齒棒桿菌質粒穩(wěn)定性的研究結果表明,重組菌株連續(xù)傳100代次后,沒有發(fā)生質粒丟失現(xiàn)象,且仍具有原代菌株的功能活性,表明重組菌株中的質粒具有結構穩(wěn)定性和分離穩(wěn)定性,推測重組質粒穩(wěn)定性可能與質粒上攜帶的RM系統(tǒng)cglⅠ基因復合體有關。報道表明,一些Ⅱ型RM基因系統(tǒng)具有分離后殺死活性,可以介導維持質粒穩(wěn)定性[8-11]。正常情況下,細胞中的M酶保護宿主染色體免遭R酶的致死性裂解。然而,一旦RM基因系統(tǒng)從細胞中被根除,隨著細胞分裂,由于稀釋,子代細胞中含有的M酶將越來越少,結果是M酶保護新復制的染色體上的許多識別位點的能力漸漸減弱。這樣,染色體DNA上未被甲基化的位點將受到攻擊,最終導致細胞死亡。同樣,RM基因系統(tǒng)丟失后,隨著細胞分裂,R酶也將被稀釋。然而,M酶和R酶在作用方式上存在不平衡,也就是說,R酶殺死細胞時,只需染色體上一處斷裂就可以充分有效(除非DNA被修復),而對于M酶而言,對宿主的保護,則需要染色體上上百個識別位點被甲基化[12]。雖然推測重組菌株的質粒穩(wěn)定性與質粒上攜帶的RM基因復合體有關,但其確切原因和機制還有待進一步研究證實。
cglⅠ基因復合體在鈍齒棒桿菌中表達后,首先通過甲基轉移酶在特異識別序列上使宿主基因組DNA胞嘧啶甲基化,以避免相應限制酶的裂解。這樣,宿主基因組DNA胞嘧啶被甲基化后,是否對重組棒桿菌的生長代謝產(chǎn)生影響尚不清楚。本實驗結果顯示,重組菌株達到對數(shù)期時間略晚于野生菌株,表明重組菌株對數(shù)期生長有些緩慢,但進入穩(wěn)定期后兩者趨于一致。分析原因可能有以下幾方面:①重組質粒在宿主菌中復制、外源基因產(chǎn)物的表達增加了細菌細胞的代謝壓力;②含有質粒的重組菌株需要更多的能量和營養(yǎng)合成更多的DNA、RNA和蛋白質等物質;③質粒的復制和表達也將與宿主細胞競爭可用的原料物質,從而影響細菌的生長速率[13-14]。
重組鈍齒棒桿菌產(chǎn)生谷氨酸的研究結果表明,重組菌株和野生菌株在實驗發(fā)酵過程中谷氨酸積累量的變化基本趨于一致,表明重組質粒的導入并未影響菌株的代謝產(chǎn)酸量。
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