低度酒主要包括果酒、黃酒、花酒等，是一種酒精含量低（一般在20%以下）的飲料酒，主要是利用谷物、水果、和鮮花為原料。由于其酒精含量低、品種繁多、營養(yǎng)價值高、消費者的喜好以及公眾對嚴重的長期健康影響的嚴重關注，低酒精葡萄酒主要以現(xiàn)代生活方式為導向。近年來中國貴州省充分利用自身豐富的糯米、水果等農業(yè)資源，推動市場上的低度酒產品越來越多，對擴大消費空間具有重要意義。在低度酒的發(fā)酵過程中，風味是評價品質的最重要特征之一。酯類是影響風味的物質之一，由酵母發(fā)酵產生，是協(xié)調葡萄酒香氣的關鍵因素。
但仍存在香氣不顯眼、酒質差、勾兌技術水平低等問題，導致低度酒行業(yè)發(fā)展緩慢。為了提高工業(yè)生產中低度酒的酯含量，人們通過添加產酯酵母、延長貯藏時間、優(yōu)化工藝條件等方法，嘗試使葡萄酒的香氣特征多樣化。然而這些方法會增加原料的損失，帶來不良氣味，降低葡萄酒的品質。目前，應用分子生物學技術構建高酯產率的釀酒酵母工程菌株已成為研究熱點。乙醇乙酰轉移酶（AAT）途徑是酵母產生酯類代謝途徑中最重要的途徑，ATT基因的表達水平對乙酸的合成有顯著影響。EAT1是一種新型AAT基因，是酯合成途徑最后一端的關鍵限速酶，在酵母中催化乙酰輔酶A和乙醇生成乙酸乙酯。
本研究通過聚合酶鏈式反應（PCR）擴增編碼AAT的EAT基因構建重組質粒Yep-PEK，然后將Yep-PEK轉化釀酒酵母W303-1A構建重組菌株W303-EAT。將重組菌株W303-EAT應用于低度酒發(fā)酵過程中，研究EAT基因對乙酸乙酯產生和香氣產生特性的影響。該研究對未來低度酒酵母菌株的優(yōu)化具有重要的參考價值。
將重組菌株W303-EAT及其親本W303-1A在50 mL YPD培養(yǎng)基中以30°C和160 rpm預培養(yǎng)12 h，然后轉移到含有重組菌株W303-EAT或其親本W303的1 mL YPD培養(yǎng)基中-1A放入100 mL YPD培養(yǎng)基中，在30°C和160 rpm下培養(yǎng)24小時。使用Bioscreen全自動微生物生長曲線分析儀（每2小時測定一次光密度（OD 680）。
實驗結果：研究表明重組菌株W303-EAT與其親本W303-1A相比，在生長性能、CO 2損失、酒精含量和還原糖含量。生物信息學分析結果表明AAT蛋白是一種疏水性、分泌性和非跨膜蛋白。然后用低度發(fā)酵酒研究了重組菌株W303-EAT與其親本菌株W303-1A在發(fā)酵性能和產香特性方面的差異。結果表明，用于發(fā)酵的重組菌株W303-EAT的米酒、藍莓酒和玫瑰酒產生的乙酸乙酯比其親本菌株W303-1A高。同時研究人員發(fā)現(xiàn)重組菌株W303-EAT發(fā)酵的米酒、藍莓酒和玫瑰酒中異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量低于其親本菌株W303-1A，表明重組菌株W303-EAT具有降低較高酒精含量的必然作用。
圖1、重組質粒Yep-PEK的詳細構建過程。
圖2、W303-1A(A)和W303-EAT(B)的細胞顯微形態(tài)。兩株菌株均為卵圓形，呈典型的單細胞形態(tài)，無胞間連鎖，細胞大小無明顯差異，充分說明EAT基因的克隆和表達對其細胞形態(tài)無不良影響。
圖3、重組菌株W303-EAT及其親本W303-1A的生長曲線。如圖所示，重組菌株W303-EAT的生長曲線與其親本W303-1A相比略有差異，說明EAT基因的過表達對菌株的生長能力有特殊的影響。
圖4、W303-1A和W303-EAT不同低度酒[玫瑰酒(A)、藍莓酒(B)和黃酒(C)]中較高酒精含量的比較。星號（*）表示不同低度酒的酒精度較高，差異顯著。從圖中看出與W303-1A相比，重組菌株W303-EAT對低發(fā)酵葡萄酒中異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量降低有顯著性差異（P<0.05），表明重組菌株W303-EAT具有具有特殊的還原高級醇的作用，對改善酒的風味具有重要意義。
圖5、W303-1A和W303-EAT不同低酒精度葡萄酒[玫瑰酒(A)、藍莓酒(B)和黃酒(C)]中乙酸乙酯含量的比較。星號（*）表示不同低度酒中乙酸乙酯含量。從圖中可以看出重組菌株W303-EAT可以提高玫瑰酒、藍莓酒、黃酒等低發(fā)酵酒發(fā)酵過程中乙酸乙酯的含量，對增強香氣和增強酒香起到積極的作用，改善酒的風味。
總結：本研究采用同源重組原理構建了過表達乙醇乙酰轉移酶（AAT）基因EAT的重組釀酒酵母菌株W303-EAT。結果表明重組菌株W303-EAT與其親本W303-1A相比，在生長性能、CO2損失、酒精含量和還原糖含量。生物信息學分析結果表明AAT蛋白是一種疏水性、分泌性和非跨膜蛋白。然后用低度發(fā)酵酒研究了重組菌株W303-EAT與其親本菌株W303-1A在發(fā)酵性能和產香特性方面的差異。結果表明用于發(fā)酵的重組菌株W303-EAT的米酒、藍莓酒和玫瑰酒產生的乙酸乙酯比其親本菌株W303-1A高。同時研究人員發(fā)現(xiàn)重組菌株W303-EAT發(fā)酵的米酒、藍莓酒和玫瑰酒中異丁醇、異戊醇和苯乙醇的含量低于其親本菌株W303-1A，表明重組菌株W303-EAT具有降低較高酒精含量的必然作用。本研究為研究過表達EAT基因的重組釀酒酵母W303-EAT的產香特性提供了新的思路。