1.2 實驗方法
1.2.1 形態(tài)學(xué)研究
1)用接種環(huán)蘸取少量菌液于MRS固體培養(yǎng)基上劃線，將平板放在25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1~2 d后，對菌落形態(tài)進(jìn)行觀察。
2)用接種環(huán)在純化后的菌落培養(yǎng)基上挑取少量細(xì)菌至載玻片上，在其上方滴加少量清水，并用接種環(huán)將細(xì)菌均勻散開后把載玻片放至火焰上方烘干固定，再滴加1滴香柏油，用低倍鏡尋找視野，再用高倍鏡觀察，最后使用油鏡觀察生物形態(tài)并拍照。
1.2.2 革蘭氏染色實驗
滴加少量菌液于載玻片上，將涂片置于火焰上方烘干固定，滴加結(jié)晶紫染液，處理1 min后用蒸餾水沖洗，滴加革蘭氏碘液，作用1 min后沖洗，滴加95%脫色酒精，作用約35 s，直至載玻片上無紫色殘留后立即水洗，最后滴加沙黃復(fù)染液染色1 min、水洗、烘干，先用低倍鏡、再用40倍鏡進(jìn)行觀察。
1.2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建
本文將16S rDNA、dnaA、atpA、pheS 基因片段測序得到的基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，選取同種部分菌屬序列進(jìn)行下載，使用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA 7.0，采用Neighbor-Joining法自舉1000次構(gòu)建親緣進(jìn)化樹。
1.2.4 生長及產(chǎn)酸能力測定
將W. cibaria BWL4以1%接種量分別接種于30根裝有4 mL的MRS液體培養(yǎng)基的試管中，28℃搖床中恒溫培養(yǎng)，分別在2、4、6、8、12、16、24、36、48 h后任意抽取其中3管，以3根空白培養(yǎng)基為對照，測定A???及對應(yīng)菌液的pH值，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，吸光度和pH值變化為縱坐標(biāo)分別繪制生長曲線和產(chǎn)酸曲線。
1.2.5 耐酸、耐膽鹽性能測定
1)耐酸性能的測定。用6 mol/L的鹽酸滴加在3根含13 mL的MRS液體培養(yǎng)基的試管中，分別調(diào)節(jié)pH值至4.0、3.0、2.5，充分混勻后，分別將不同pH值的培養(yǎng)基各自分裝至3根試管中。將菌液以1%的接種量分別接種至所有培養(yǎng)基中，28℃搖床恒溫培養(yǎng)24 h，以未調(diào)節(jié)pH值的培養(yǎng)基為對照組，測各種菌液于600 nm處的吸光度。
2)耐膽鹽性能的測定。與上述耐酸性能測定方法相似，以1%的接種量將活化的菌液接種至牛膽鹽體積分?jǐn)?shù)分別為0、0.1%、0.2%、0.3%的液體培養(yǎng)基中，恒溫條件下28℃培養(yǎng)24 h，以未加牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基為對照組，測各組菌液于600 nm處的吸光度。
1.2.6 抗真菌譜測定
本實驗采用平板對峙法，以灰霉菌、鐮刀菌、擴展青霉、黃曲霉為病原菌，將保存于凍存管中的真菌菌塊接種于PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7~10 d，此時真菌已長至滿盤，取無菌打孔器在靠近平板邊緣位置取直徑5 mm的霉菌菌餅，用鑷子將菌餅接種到新的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)12~24 h；用移液槍吸取10 μL活化2代后的W. cibaria BWL4菌液在距離菌餅4 cm處劃線，25℃恒溫培養(yǎng)3 d后觀察抑菌效果。
1.2.7 抑細(xì)菌譜測定
以金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門氏菌、丙二酸鹽克羅諾362為指示菌，以LB肉湯作為指示菌培養(yǎng)基，將活化1代后的指示菌以1%的接種量繼續(xù)在37℃搖床中恒溫培養(yǎng)至A???值為0.8左右。
將候選菌株以1%的接種量接種于MRS肉湯中，28℃搖床恒溫培養(yǎng)36~48 h，取8 mL菌液8000 r/min離心3 min，保留上清液，并用無菌的0.22 μm的水系濾頭過濾，將濾后的上清液分成2份，一份不變，另一份調(diào)pH值為7.0。配置0.75%~1.00%的LB半固體培養(yǎng)基和1.5%~2.0%的素瓊脂培養(yǎng)基并滅菌，將10 mL左右素瓊脂培養(yǎng)基倒至平板上；待其完全凝固后用燒過的鑷子取3個滅過菌的牛津杯放置培養(yǎng)基上，將指示菌以3%的接種量接種于溫度為50℃的LB半固體培養(yǎng)基中，充分混勻，緩慢倒入培養(yǎng)基直至厚度達(dá)到牛津杯的1/3~1/2；待培養(yǎng)基完全凝固后用鑷子取出牛津杯，向3個孔中分別加入150 μL上清原液、pH值為7.0的上清液和MRS肉湯；將平板緩慢平放于25℃恒溫培養(yǎng)基中培養(yǎng)約18 h后觀察抑菌圈大小，拍照并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。
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