摘要
口腔共生鏈球菌在口腔生物膜形成中起著關(guān)鍵作用，并通過(guò)與致病菌（如變形鏈球菌）競(jìng)爭(zhēng)和拮抗其生長(zhǎng)來(lái)促進(jìn)牙齒健康。共生鏈球菌有效利用口腔中的多種碳水化合物對(duì)其持久定植至關(guān)重要，然而對(duì)這些生物體碳水化合物分解代謝的調(diào)控知之甚少。我們以豐富的口腔共生菌戈登氏鏈球菌DL1株為模型，利用外切-β-D-果糖苷酶基因(fruA)和一個(gè)果糖/甘露糖糖：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)酶II操縱子(levDEFG)作為模型系統(tǒng)，研究了其碳水化合物分解代謝物抑制(CCR)。功能研究證實(shí)了FruA和LevD在戈登氏鏈球菌中的預(yù)測(cè)作用。ManL，一種果糖/甘露糖型酶II PTS滲透酶的AB結(jié)構(gòu)域，參與了葡萄糖、甘露糖、半乳糖和果糖的利用，并對(duì)fruA和levD操縱子的CCR施加主要控制。與變形鏈球菌不同，ManL依賴(lài)的CCR不是糖特異性的，并且半乳糖在戈登氏鏈球菌中能非常有效地引發(fā)CCR。戈登氏鏈球菌中明顯的ccpA同源物的失活實(shí)際上增強(qiáng)了對(duì)fruA和levD的CCR，這種效應(yīng)可能源于其已證實(shí)的對(duì)manL表達(dá)的抑制作用。因此，口腔病原體變形鏈球菌和口腔共生菌戈登氏鏈球菌在CCR控制機(jī)制上存在一些相似性和根本性差異，這可能最終被用來(lái)增強(qiáng)健康相關(guān)共生菌在口腔生物膜中的競(jìng)爭(zhēng)力。
引言
人類(lèi)口腔提供了一個(gè)復(fù)雜而豐富的營(yíng)養(yǎng)源，支持著多種微生物的生長(zhǎng)，目前已在口腔中檢測(cè)到超過(guò)750種細(xì)菌系統(tǒng)型。然而，相對(duì)較少的屬占據(jù)了種群的大部分，口腔鏈球菌是人類(lèi)口腔最早的定植者和最豐富的居民之一?？谇还采溓蚓ㄑ溓蚓?、唾液鏈球菌群、米氏鏈球菌群和咽峽炎鏈球菌群的成員，其中許多與牙齒和牙周健康相關(guān)。相比之下，人類(lèi)齲齒的主要病原體變形鏈球菌通常不在健康牙齒組織上占顯著比例。相反，當(dāng)宿主的飲食過(guò)度富含碳水化合物時(shí)，這種微生物會(huì)大量繁殖，這在很大程度上是由于其與許多共生鏈球菌相比，具有更強(qiáng)的產(chǎn)酸和耐酸能力。值得注意的是，許多口腔共生鏈球菌可以通過(guò)產(chǎn)生過(guò)氧化氫和其他抑制性物質(zhì)來(lái)抑制變形鏈球菌的生長(zhǎng)。由于人們普遍認(rèn)識(shí)到齲齒具有生態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，因此全面了解共生菌用來(lái)獲得相對(duì)于致齲微生物的選擇性優(yōu)勢(shì)的機(jī)制，將有助于合理設(shè)計(jì)技術(shù)，以阻止不良生物的定植和致病。
碳水化合物是鏈球菌屬生長(zhǎng)的主要能量來(lái)源，它們?nèi)狈ν暾暮粑?。雖然有一些鏈球菌通過(guò)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或同向轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)內(nèi)化碳水化合物的例子，但攝取碳水化合物的主要高親和力、高通量途徑是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)依賴(lài)的糖：磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)。PTS由通用組分酶I(EI)和組氨酸磷酸載體蛋白(HPr)，以及一系列底物特異性酶II(EII)復(fù)合物組成。EI催化PEP對(duì)HPr的His15進(jìn)行磷酸化，隨后磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到PTS滲透酶的EIIA結(jié)構(gòu)域，然后到EIIB結(jié)構(gòu)域，接著是膜相關(guān)EIIC結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的單糖或二糖的內(nèi)化和并發(fā)磷酸化，對(duì)于某些滲透酶，有時(shí)還涉及EIID結(jié)構(gòu)域。與大多數(shù)細(xì)菌一樣，當(dāng)存在快速代謝的碳水化合物時(shí)，鏈球菌中利用非偏好碳水化合物的基因會(huì)受到抑制。因此，碳分解代謝物抑制(CCR)在這些細(xì)菌中很常見(jiàn)，使生物體能夠優(yōu)化能量生成。
大多數(shù)低G+C含量革蘭氏陽(yáng)性菌中CCR的主要途徑涉及PTS的HPr和分解代謝物控制蛋白A(CcpA)，后者結(jié)合在CCR敏感基因啟動(dòng)子區(qū)域的分解代謝物響應(yīng)元件(CRE)上并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄。CcpA的DNA結(jié)合活性通過(guò)與其Ser46磷酸化形式的HPr(HPr-Ser-P)相互作用而增強(qiáng)，并且在某些情況下可以被某些糖酵解中間體（如果糖-1,6-二磷酸）的存在所刺激。盡管變形鏈球菌中的CcpA同源物可以影響中心碳代謝的調(diào)節(jié)，但CcpA在變形鏈球菌的CCR中并不起主導(dǎo)作用。相反，HPr-Ser-P和三種EII復(fù)合物(EIIABMan,FruI和EIILev)在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)非偏好碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝施加主要控制。
口腔共生鏈球菌和變形鏈球菌的代謝途徑、營(yíng)養(yǎng)需求和基因組結(jié)構(gòu)相似，因此它們可能在口腔中競(jìng)爭(zhēng)共同的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。作為最豐富的口腔共生菌之一和口腔的早期定植者，戈登氏鏈球菌在口腔生物膜形成過(guò)程中與各種口腔細(xì)菌相互作用，并能夠拮抗變形鏈球菌的生長(zhǎng)。值得注意的是，變形鏈球菌和戈登氏鏈球菌在CCR調(diào)節(jié)方面已經(jīng)存在一些明顯差異。特別是，雖然CcpA在變形鏈球菌的CCR中不占主導(dǎo)地位，但戈登氏鏈球菌的ccpA突變體顯示精氨酸脫亞胺酶途徑的CCR喪失，淀粉酶結(jié)合蛋白表達(dá)異常，以及青霉素耐受性喪失。如果口腔共生菌和變形鏈球菌確實(shí)以根本不同的方式管理CCR，那么或許可以設(shè)計(jì)出能夠破壞變形鏈球菌持久存在能力而不干擾共生菌生長(zhǎng)的治療方法。使用我們?cè)谧冃捂溓蚓透甑鞘湘溓蚓酗@示具有相似功能的兩個(gè)CCR敏感模型系統(tǒng)，我們證明了這些競(jìng)爭(zhēng)性微生物在碳水化合物分解代謝的整體調(diào)控上存在核心相似性和顯著差異。
材料與方法
細(xì)菌菌株和培養(yǎng)條件。本研究中使用的野生型戈登氏鏈球菌DL1株及其衍生株在腦心浸液肉湯(BHI;Difco Laboratories,Detroit,MI)中于37°C、5%CO2和95%空氣條件下維持，必要時(shí)添加以下濃度的抗生素：卡那霉素(1.0 mg ml?1)、紅霉素(10μg ml?1)和壯觀霉素(500μg ml?1)。用于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)測(cè)定和測(cè)量生長(zhǎng)速率的戈登氏鏈球菌培養(yǎng)物在含有指定量的葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖或菊粉的TV基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備。用于PTS測(cè)定的細(xì)胞在保持85%N2、10%H2和5%CO2的厭氧室中培養(yǎng)。所有化學(xué)試劑和抗生素均購(gòu)自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。使用Bioscreen C監(jiān)測(cè)儀(Oy Growth Curves AB,Helsinki,Finland)生成戈登氏鏈球菌菌株的生長(zhǎng)曲線，每30分鐘讀取一次讀數(shù)。大腸桿菌菌株在Luria-Bertani培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，需要時(shí)添加以下濃度的抗生素：卡那霉素(40μg ml?1)、紅霉素(300μg ml?1)和壯觀霉素(50μg ml?1)。
DNA操作。采用標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒。所有限制性內(nèi)切酶和修飾酶均購(gòu)自Invitrogen(Carlsbad,CA)或New England Biolabs(Beverly,MA)，并按供應(yīng)商推薦使用。使用購(gòu)自Qiagen(Valencia,CA)的QiaQuick DNA純化試劑盒進(jìn)行DNA純化。所有引物由Integrated DNA Technologies(Coralville,IA)合成。采用PCR連接誘變方法，用非極性紅霉素抗性標(biāo)記替換fruA、levD和manL的編碼序列。為構(gòu)建manL ccpA雙突變體，將ccpA的0.9-kbp內(nèi)部片段通過(guò)PCR擴(kuò)增并克隆到pUC19上。隨后將非極性壯觀霉素抗性盒插入ccpA基因的EcoRV位點(diǎn)，并通過(guò)感受態(tài)轉(zhuǎn)化將該突變引入manL突變體中。所有工程菌株均通過(guò)PCR和DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，包括確定用于重組的臂的染色體內(nèi)容序列，以確保在目標(biāo)基因之外沒(méi)有引入意外的突變。
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