1.5病毒生長曲線繪制
將第4代的細(xì)胞上清按照感染復(fù)數(shù)(MOI)大于1接種于原代羊睪丸細(xì)胞，于接種后8、16、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216 h收取細(xì)胞上清，按照Reed-Muench法計算不同時間點細(xì)胞液上清TCID50值，將不同時間點的TCID50繪制曲線以觀察分離毒株的增殖動態(tài)。
1.6電鏡觀察
取純化后的病毒液滅活制備病毒懸液，將制備好的懸浮液樣品，用吸管吸取，滴于帶有支持膜的銅網(wǎng)上。根據(jù)懸液內(nèi)樣品的濃度，立即或放置數(shù)分鐘后，用濾紙從液珠邊緣吸去多余液體，滴上染液，染色時間30 s。用濾紙吸去染液，待干燥后通過透射電子顯微鏡觀察病毒粒子形態(tài)。
1.7免疫熒光鑒定
分離第4代細(xì)胞上清接種于96孔板中的PLT細(xì)胞。待最高劑量病毒感染孔超過50%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，將96孔板浸泡于置于-20℃冰箱預(yù)冷的甲醇中，滅活病毒并固定細(xì)胞30 min。隨后取出96孔板，顯微鏡下觀察細(xì)胞，并用免疫熒光法檢測病毒蛋白。一抗為本實驗室保存的鼠抗LSDV P32蛋白單克隆抗體(1∶400稀釋)，二抗為FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500稀釋)，用健康小鼠血清作為陰性對照，倒置熒光顯微鏡進行觀察、拍照。
1.8 GPCR基因的測序及分析
采用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取第4代細(xì)胞上清DNA，并使用引物GPCR-F/GPCR-R檢測病毒(引物序列見表1)，回收目的基因，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。利用生物信息學(xué)軟件DNAStar7.0和MEGA6分析測得的GPCR基因序列，與其它分離毒株(見表2)使用MEGA7中的Clustal W對核苷酸進行比較比對及遺傳進化分析并使用TVBOT進行美化。核苷酸相似性比對的百分比由DNASTAR(Lasergene Inc.，Madison，USA)的MegAlign程序生成。使用MEGA 7進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并使用最適合數(shù)據(jù)集的模型構(gòu)建最大似然樹。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的可靠性評價采用bootstrap分析與1 000個重復(fù)。
表2 LSDV參考分離株
2結(jié)果
2.1組織樣本PCR檢測
以組織樣本提取的核酸為模板，采用P32蛋白編碼基因特異性引物L(fēng)SDV-F/LSDV-R進行PCR擴增，獲得的片段大小約為192 bp，與預(yù)期片段大小相符，表明病牛組織樣本中可能存在LSDV(如圖1)。
MV.DL500 DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；NC.陰性對照；PC.陽性對照；HLJ.Heilongjiang/2022株待檢樣本；JL.Jiling/2022株待檢樣本；JX.Jiangxi/2022株待檢樣本
圖1病料中LSDV的PCR檢測
2.2病毒細(xì)胞病變觀察及TCID50的測定
將上述檢測為陽性的組織樣本液上清，接種PLT細(xì)胞，盲傳到第4代出現(xiàn)CPE現(xiàn)象。PCR檢測結(jié)果(圖略)三株病毒第1、3、4代細(xì)胞培養(yǎng)物均為陽性。將分離出的3個LSDV毒株，分別命名為LSDV/Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株和LSDV/Jiangxi/2022株。取不同稀釋度的3株病毒分別接種PLT細(xì)胞，計算病毒的TCID50，結(jié)果顯示，LSDV/Heilongjiang/2022毒株的TCID50為1×106.0 TCID50·mL-1、LSDV/Jiling/2022毒株的TCID50為1×105.3 TCID50·mL-1，而LSDV/Jiangxi/2022毒株的TCID50為1×105.1 TCID50·mL-1。
2.3分離病毒的電鏡觀察
經(jīng)透射電鏡下觀察，病毒粒子呈磚形或橢圓形(圖2)。根據(jù)標(biāo)尺使用Image J軟件估算LSDV/Heilongjiang/2022株病毒平均大小約240 nm×280 nm、LSDV/Jiangxi/2022株病毒粒子平均大小約276 nm×245 nm、LSDV/Jiling/2022株病毒粒子平均大小約210 nm×200 nm。
圖2 3株LSDV的透射電鏡觀察(50 000×)
2.4分離病毒的免疫熒光鑒定
間接免疫熒光試驗可以觀察到，3株分離病毒感染細(xì)胞呈現(xiàn)特異性黃綠色熒光，未接毒對照細(xì)胞無熒光，鑒定結(jié)果見圖3。綜合電鏡觀察、免疫熒光(IFA)鑒定與PCR檢測結(jié)果可知，本試驗成功從牛病變組織中分離到LSDV/Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株以及LSDV/Jiangxi/2022株。
A1、B1、C1.分別為接種LSDV/Jiling/2022、LSDV/Heilongjiang/2022以及LSDV/Jiangxi/2022試驗組；A2、B2、C2.陰性對照組
圖3 3株LSDV的間接免疫熒光檢測(IFA)
2.5分離毒株的增殖動態(tài)測定
將Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株及LSDV/Jiangxi/2022株盲傳至第4代的細(xì)胞上清分別接種于PLT細(xì)胞。接種后8 h，LSDV/Heilongjiang/2022株病毒滴度可達到102.8 TCID50·mL-1；接種96 h后，滴度最高，可達到106.0 TCID50·mL-1；接種120 h后，滴度開始下降，可達到105.7 TCID50·mL-1；接種216 h后，滴度為104.7 TCID50·mL-1(如圖4a)。
a.LSDV/Heilongjiang/2022株的生長曲線；b.LSDV/Jiling/2022株的生長曲線；c.LSDV/Jiangxi/2022株的生長曲線
圖4 3株LSDV的一步生長曲線
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