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耐鹽工程弧菌 VCOD-15生長(zhǎng)曲線及降解復(fù)雜有機(jī)污染物能力研究

來源：發(fā)布時(shí)間:2025-11-24 17:25:36 瀏覽：52 次

研究簡(jiǎn)介

本文研究了通過工程化天然弧菌（Vibrio natriegens）來實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜有機(jī)污染物的生物修復(fù)。工業(yè)廢水、石油污染和塑料污染對(duì)全球海洋生物安全構(gòu)成重大威脅，因?yàn)檫@些污染物具有毒性、致突變性和持久性。微生物在生物修復(fù)中的應(yīng)用受到有機(jī)污染物復(fù)雜性和耐鹽性限制。研究人員利用合成生物學(xué)技術(shù)，將天然弧菌（Vibrio natriegens）工程化，使其能夠生物修復(fù)含鹽廢水和土壤中的復(fù)雜有機(jī)污染物。研究團(tuán)隊(duì)通過插入自然轉(zhuǎn)化能力主調(diào)控基因tfoX到V.natriegens菌株Vmax的染色體1中，并過表達(dá)以增強(qiáng)DNA攝取和整合能力。通過化學(xué)合成和酵母組裝了五個(gè)降解基因簇（總43 kb），并開發(fā)了一種基于Vmax的迭代自然轉(zhuǎn)化方法（INTIMATE），將這些基因簇轉(zhuǎn)移到Vmax中。

這些基因簇能夠降解單環(huán)和多環(huán)芳烴，包括苯酚、萘、聯(lián)苯、二苯并呋喃和甲苯等有機(jī)污染物。通過在不同鹽度條件下培養(yǎng)Vmax，并添加有機(jī)污染物，驗(yàn)證了基因簇的功能。結(jié)果顯示，Vmax在高鹽條件下對(duì)有機(jī)污染物的耐受性優(yōu)于其他菌株。通過轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與有機(jī)污染物外排相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。通過自然轉(zhuǎn)化方法，成功將tfoX基因插入Vmax基因組，并優(yōu)化了自然轉(zhuǎn)化效率。通過篩選，確定了chr2_297位點(diǎn)作為基因簇插入的最佳位置。最終構(gòu)建了一個(gè)能夠同時(shí)降解五種有機(jī)污染物的V.natriegens菌株VCOD-15。在含有多種有機(jī)污染物的工業(yè)廢水中，VCOD-15能夠同時(shí)降解聯(lián)苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯。在48小時(shí)內(nèi)，VCOD-15能夠去除98.9%的聯(lián)苯、98.5%的苯酚、99.6%的萘、99.7%的二苯并呋喃和97.7%的甲苯。在含有有機(jī)污染物的鹽堿土壤中，VCOD-15也能夠降解聯(lián)苯、苯酚、萘和二苯并呋喃。

通過HRGC-MS分析，檢測(cè)到了穩(wěn)定同位素標(biāo)記的中間代謝產(chǎn)物，證實(shí)了VCOD-15在土壤中的降解能力。文章討論了VCOD-15的局限性，包括在低鹽環(huán)境中的生長(zhǎng)能力不如P.putida和B.xenovorans，以及不能完全礦化污染物或使用它們作為碳源。提出了通過引入代謝基因簇來解決這些限制的可能性，并探討了將基因簇設(shè)計(jì)和插入策略應(yīng)用于其他降解菌株的可能性，如P.putida KT2440。此外，還討論了通過適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化來提高這些菌株的魯棒性、耐受性和修復(fù)效率的可能性。本研究展示了通過工程化的V.natriegens菌株VCOD-15，能夠有效降解復(fù)雜有機(jī)污染物，為處理含鹽廢水和土壤中的有機(jī)污染物提供了一種新的生物修復(fù)方法。通過進(jìn)一步的基因工程和適應(yīng)性進(jìn)化，有望進(jìn)一步提高這些工程菌株的性能，以應(yīng)對(duì)更廣泛的環(huán)境挑戰(zhàn)。

Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀的應(yīng)用

使用Bioscreen C儀器測(cè)量細(xì)菌菌株的生長(zhǎng)曲線。通過在30°C的LB培養(yǎng)基中以1：100的比例傳代培養(yǎng)過夜細(xì)菌培養(yǎng)物，菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600為0.4–0.5），并重懸于相應(yīng)的培養(yǎng)基中，然后將5μl這種標(biāo)準(zhǔn)化的細(xì)菌懸浮液接種到100μl所需的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（LB1/4、LB、LB3、LB5、LB7、NSS和M9）一式三份。將板在30°C下孵育，隔夜每小時(shí)測(cè)量一次OD600，同時(shí)連續(xù)高速振蕩。通過測(cè)量OD600值來評(píng)估菌株的生長(zhǎng)情況，從而比較不同菌株在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)能力。Bioscreen C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀通過連續(xù)監(jiān)測(cè)OD600值，能夠?qū)崟r(shí)了解菌株的生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)，包括生長(zhǎng)速率、最大生物量等關(guān)鍵參數(shù)，提供了直觀的生長(zhǎng)曲線圖，幫助研究人員更直觀地比較不同菌株的生長(zhǎng)差異，從而更好地理解菌株的生長(zhǎng)特性和適應(yīng)性。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過工程化的天然弧菌（Vibrio natriegens）菌株VCOD-15，成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)復(fù)雜有機(jī)污染物的生物修復(fù)。通過插入自然轉(zhuǎn)化能力主調(diào)控基因tfoX到V.natriegens菌株Vmax的染色體1中，并過表達(dá)以增強(qiáng)DNA攝取和整合能力?；瘜W(xué)合成和酵母組裝了五個(gè)降解基因簇（總43 kb），并開發(fā)了一種基于Vmax的迭代自然轉(zhuǎn)化方法（INTIMATE），將這些基因簇轉(zhuǎn)移到Vmax中。成功構(gòu)建了能夠同時(shí)降解五種有機(jī)污染物（聯(lián)苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯）的V.natriegens菌株VCOD-15。在實(shí)驗(yàn)室條件下，VCOD-15能夠同時(shí)降解多種有機(jī)污染物。在48小時(shí)內(nèi)，VCOD-15能夠去除98.9%的聯(lián)苯、98.5%的苯酚、99.6%的萘、99.7%的二苯并呋喃和97.7%的甲苯。在含有多種有機(jī)污染物的工業(yè)廢水中，VCOD-15表現(xiàn)出高效的降解能力，優(yōu)于其他自然降解菌株。通過生物修復(fù)技術(shù)，VCOD-15能夠有效降解復(fù)雜有機(jī)污染物，為處理含鹽廢水和土壤中的有機(jī)污染物提供了一種新的方法。

圖1、a)總結(jié)復(fù)雜有機(jī)污染物修復(fù)菌株開發(fā)的示意圖。b）V.natriegens Vmax，惡臭假單胞菌KT2440，異形鞘伯克霍爾德菌LB400的V.生物量（OD600），和鞘氨醇單SHPJ-2網(wǎng)格上方的灰色條表示培養(yǎng)菌株的七種培養(yǎng)基，含有胰蛋白胨和酵母提取物作為碳和氮源的培養(yǎng)基，具有不同鹽度（LB1/4、LB、LB3、LB5和LB7）和兩種添加甘油和NH4Cl的鹽溶液作為唯一的氮和碳源（M9和NSS）。

圖2、a）含有污染物（分別為聯(lián)苯、苯酚、萘、DBF和甲苯）的LB1/4、LB、LB3和LB5培養(yǎng)基中的候選菌株生長(zhǎng)速率。氣泡大小表示最大生物量（OD600）與培養(yǎng)時(shí)間（h）的比率。b）描述tfoX插入安排的示意圖。將lac縱子插入V的int位點(diǎn)。納特里根ATCC 14048生成V。納特里根Vmax的。受誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PT7調(diào)控的tfoX基因插入chr的int位點(diǎn)。Vmax的1個(gè)，DdRp的下游和rsmE的上游。c）使用0.5–400 ng p15A質(zhì)粒進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化的VCOD-2轉(zhuǎn)化測(cè)定。d）使用染色體中0.5–400 ngΔwbfF：：CmR（3 kb/3 kb）供體DNA進(jìn)行VCOD-2轉(zhuǎn)化測(cè)定，自然轉(zhuǎn)化。e）使用5 ngΔwbfF：：CmR供體DNA進(jìn)行VCOD-2轉(zhuǎn)化測(cè)定，該供體DNA含有指定的自然轉(zhuǎn)化同源側(cè)翼。f）菌株Vmax、VCOD-1和VCOD-2在LB3培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)，以O(shè)D600測(cè)量。g）選擇作為CHR上候選插入位點(diǎn)的12個(gè)中性位點(diǎn)的分布。Vmax的2。h）通過自然轉(zhuǎn)化插入12個(gè)位點(diǎn)的表達(dá)sfGFP的細(xì)胞的熒光。i，使用2 kb側(cè)翼同源片段和sfgfp供體DNA表征12個(gè)位點(diǎn)的重組效率。

圖3、不同菌株（Vmax、SHPJ-2、LB400和KT2440）在含有聯(lián)苯（BP）、苯酚、萘（NAP）、二苯并呋喃（DBF）和甲苯的LB1/4培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線。所有菌株在30℃下培養(yǎng)。芳香污染物濃度梯度設(shè)置為：0.5 mM、1 mM、3 mM、5 mM、10 mM。統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)用3個(gè)生物重復(fù)的平均值±SD表示。

圖4、通過VCOD-15和基因表達(dá)水平檢查復(fù)雜有機(jī)污染物的修復(fù)。a，插入VCOD-15染色體的基因簇的示意圖（VmaxΔint：：tfoXΔchr2_297：：bphA1234BCKHJID：：dmpLMNOP：nahAabcdBFCYED：：dbfA1234BC：：xylABCMN）。將五個(gè)基因簇（bph、dmp、no、dbf和xyl）依次插入中性位點(diǎn)chr2_297。氯霉素抗性基因CmR顯示為深綠色箭頭。連接基因簇的長(zhǎng)度為43 kb。b，對(duì)工程V中復(fù)雜污染物降解基（c，聯(lián)苯;d，苯酚;e，萘;f，DBF;g，甲苯）。彩色（VCOD-15）和灰色（Vmax）點(diǎn)反映污染物濃度（左y軸）。彩色（VCOD-15）和灰色（Vmax）條形表示污染物的殘留數(shù)量（右y軸）。h，菌株VCOD-2和VCOD-15在LB3培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)測(cè)量為OD600。

圖5、VCOD-15對(duì)活性污泥生物反應(yīng)器中復(fù)雜污染工業(yè)廢水樣品的生物修復(fù)。a)鈉工業(yè)廢水樣品中的Vmax、鞘氨醇單胞菌屬SHPJ-2、B.xenovorans LB400和P.putida KT2440的生長(zhǎng)曲線，測(cè)量為OD600。菌株在廢水樣品BZ I（a）和DL I（b）中培養(yǎng)，加入10 g l-1酵母提取物和相應(yīng)濃度的污染物（如面板上方的灰色條所示）在30°C下振蕩。c，d)菌株的聯(lián)苯修復(fù)效率Vmax菌株、VCOD-15菌株、P.putida B6-2菌株和工業(yè)廢水樣品BZ I(c)和DL I(d)中的B.xenovorans LB400（c）和DL I（d）e)用于修復(fù)工業(yè)廢水樣品中復(fù)雜有機(jī)污染物的活性污泥生物反應(yīng)器示意圖。f–j，復(fù)雜有機(jī)污染物。f，聯(lián)苯;g，苯酚;h，萘;i，二苯并呋喃;J，甲苯）在工業(yè)廢水樣品中VCOD-15的修復(fù)效率，在e中所示的活性污泥生物反應(yīng)器中進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)分析：數(shù)據(jù)表示為三個(gè)生物學(xué)一式三份的平均值±s.d.（a，b）。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)（c，d）的平均值±s.d.。使用單因素方差分析（ANOVA）和Tukey多重比較檢驗(yàn)評(píng)估統(tǒng)計(jì)顯著性。數(shù)據(jù)表示為s.d.（f-j）三個(gè)生物學(xué)一式三份±平均值。

總結(jié)

工業(yè)廢水、石油污染和塑料污染因其毒性、致突變性和持久性而成為全球海洋生物安全的重大威脅1。微生物在生物修復(fù)中的使用受到有機(jī)污染物復(fù)雜性和對(duì)鹽水脅迫的有限耐受性的限制。在這項(xiàng)研究中，研究人員使用了合成生物學(xué)將Vibrio natriegens改造成一種能夠生物修復(fù)鹽廢水和土壤中復(fù)雜有機(jī)污染物的菌株。能力主調(diào)節(jié)基因tfoX入V的1號(hào)染色體中。natriegens菌株Vmax并過表達(dá)以增強(qiáng)DNA攝取和整合。降解基因簇在酵母中化學(xué)合成和組裝。開發(fā)了一種基因組工程方法（基于Vmax的迭代自然轉(zhuǎn)化，具有擴(kuò)增的tfoX效應(yīng)）將五個(gè)基因簇（總共43 kb）轉(zhuǎn)移到Vmax中。該工程菌株能夠生物修復(fù)氯堿廠和煉油廠的工業(yè)廢水樣品中的五種有機(jī)污染物（聯(lián)苯、苯酚、萘、二苯并呋喃和甲苯），涵蓋從單環(huán)化合物到多環(huán)化合物的廣泛底物范圍。

Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀精確地測(cè)量細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線，通過監(jiān)測(cè)V.natriegens Vmax在不同鹽度條件下的生長(zhǎng)曲線，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)Vmax在高鹽環(huán)境中對(duì)有機(jī)污染物具有較高的耐受性。通過獲得生長(zhǎng)曲線數(shù)據(jù)圖，能夠優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，更高效地進(jìn)行菌株篩選和生長(zhǎng)條件優(yōu)化，選擇最適合的菌株和培養(yǎng)條件進(jìn)行后續(xù)的基因工程和生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)。為后續(xù)的基因工程和生物修復(fù)實(shí)驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。本研究展示了通過工程化的V.natriegens菌株VCOD-15，能夠有效降解復(fù)雜有機(jī)污染物，為處理含鹽廢水和土壤中的有機(jī)污染物提供了一種新的生物修復(fù)方法。通過進(jìn)一步的基因工程和適應(yīng)性進(jìn)化，有望進(jìn)一步提高這些工程菌株的性能，以應(yīng)對(duì)更廣泛的環(huán)境挑戰(zhàn)。

耐鹽工程弧菌 VCOD-15生長(zhǎng)曲線及降解復(fù)雜有機(jī)污染物能力研究

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