摘要
在革蘭氏陰性菌中，多藥外排泵負責排出對生長有害的化學物質。部分外排泵由內源性效應物誘導，另一些則受非生物或生物信號調控表達。在惡臭假單胞菌中，TtgABC外排泵是主要的抗生素排出系統(tǒng)，通過TtgR介導的操縱子表達調控響應外源性抗生素。質粒編碼的TtgGHI外排泵在親本菌株的抗生素耐藥性中作用較弱，但在TtgABC缺陷的同基因背景中至關重要。ttgGHI的表達受TtgV調節(jié)子抑制，該調節(jié)子可將吲哚識別為效應物，而惡臭假單胞菌自身不產生吲哚。由于假單胞菌不合成吲哚，這種吲哚依賴性抗生素耐藥性似乎是微生物群落水平耐藥機制的一部分。惡臭假單胞菌能夠識別培養(yǎng)基中添加的吲哚或混合微生物群落中大腸桿菌產生的吲哚。轉錄組分析顯示，吲哚特異性響應涉及43個基因的激活和23個基因的抑制。吲哚不僅增強TtgGHI泵的表達，還上調與鐵穩(wěn)態(tài)相關的基因以及氨基酸分解代謝基因。在TtgABC缺陷的惡臭假單胞菌中，氨芐西林等殺菌化合物會導致細胞死亡；而大腸桿菌與惡臭假單胞菌ΔttgABC共培養(yǎng)時，吲哚依賴性外排泵的誘導可使該突變體在氨芐西林存在下存活。
引言
惡臭假單胞菌是一類廣泛存在的微生物，可在植物根際土壤中以及水生系統(tǒng)中以懸浮態(tài)或生物膜形式附著于生物和非生物表面。該物種在多種環(huán)境條件下的存活和增殖，依賴于其豐富的代謝活性以及對其他微生物產生的抗菌化合物的響應能力。
惡臭假單胞菌DOT-T1E菌株分離自格拉納達污水處理廠，能夠在高濃度芳香族化合物等有機溶劑存在下生長。此后研究表明，該菌株對多種有毒化合物具有耐藥性，包括染料、重金屬以及多種殺菌抗生素（如氨芐西林、哌拉西林、諾氟沙星）和抑菌抗生素（如氯霉素、四環(huán)素、紅霉素）。該微生物對殺菌和抑菌抗生素的主要耐藥機制，是通過耐藥性-結節(jié)形成-細胞分裂（RND）家族的多種多藥外排泵將抗生素排出細胞。已在惡臭假單胞菌DOT-T1E的基因組中鑒定出19個RND外排泵，其中兩個已通過實驗證實參與抗生素排出：其一為TtgABC（T1E_0241-0243），位于染色體上，被認為是該菌株中與抗生素耐藥性最相關的外排泵；另一個是質粒編碼的TtgGHI，其在有機溶劑排出中更為重要。
TtgABC泵的表達具有基礎水平，且受TetR家族的TtgR調節(jié)子調控，可響應特定抗生素和黃酮類化合物。TtgGHI外排泵的表達受IclR家族的抑制子TtgV調控，該抑制子不將抗生素識別為效應物，而是識別吲哚——一種假單胞菌不合成的分子，且已被證實是TtgV的高效效應物。
吲哚被認為是一種細胞內和細胞間信號分子。我們推測這兩種外排泵在抗生素耐藥性中發(fā)揮不同作用：TtgABC屬于單細胞水平的自身耐藥機制，而吲哚誘導的TtgGHI則屬于群落水平的耐藥機制。在腸桿菌中，色氨酸通過色氨酸酶作用產生吲哚，該過程不被細胞代謝，而是分泌到胞外培養(yǎng)基中，濃度可達0.5 mM。胞外吲哚可被大腸桿菌細胞攝取，并參與調控多種過程，如耐藥性、質粒穩(wěn)定性、某些致病菌的毒力特征以及生物膜形成，因此吲哚可作為種內信號分子。此外，吲哚也可被非腸桿菌攝取，并影響多種表型，例如抑制黑曲霉生長、增強腸炎沙門氏菌的耐藥性、促進銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌和烏納馬伯克霍爾德菌的生物膜形成，還可減弱銅綠假單胞菌的毒力，因此吲哚也是一種種間信號分子。
本研究探討了不同同基因惡臭假單胞菌菌株在有無吲哚存在時，對殺菌和抑菌抗生素的響應；以惡臭假單胞菌為模型系統(tǒng)，明確了吲哚作為種間信號的作用。吲哚可影響惡臭假單胞菌中至少76個基因的表達模式，這些基因涉及細胞代謝、細胞壁生物合成和應激防御，結果支持吲哚在惡臭假單胞菌中作為信號分子的功能。本研究證實，腸桿菌產生的吲哚可通過誘導TtgGHI外排泵并促進抗生素排出，使假單胞菌在藥物存在下存活。
實驗方法
菌株與培養(yǎng)條件
細菌細胞在液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，惡臭假單胞菌培養(yǎng)溫度為30°C，大腸桿菌為37°C，在搖床中以200轉/分鐘振蕩培養(yǎng)。必要時添加適當抗生素，終濃度如下：卡那霉素50μg/mL、利福平20μg/mL；本研究中使用的其他抗生素濃度見正文。
氨芐西林存在下大腸桿菌與惡臭假單胞菌的共培養(yǎng)實驗
在該系列實驗中，將不同細胞接種到20 mL LB培養(yǎng)基中，在無抗生素條件下單獨培養(yǎng)12-14小時；用無菌LB肉湯將這些培養(yǎng)物的濁度調整至660 nm處吸光度為0.1（約1±0.1×10^5 CFU/mL），然后將10 mL大腸桿菌細胞與10 mL惡臭假單胞菌DOT-T1E或惡臭假單胞菌T1E-18混合；以各菌株單獨培養(yǎng)作為對照。如正文所述，向所有培養(yǎng)物中添加氨芐西林（300μg/mL），隨后在30°C振蕩培養(yǎng)20小時。實驗結束時取樣，系列稀釋后涂布到選擇性培養(yǎng)基上：添加20μg/mL利福平的固體LB培養(yǎng)基用于計數(shù)惡臭假單胞菌DOT-T1E；添加利福平和卡那霉素的固體LB培養(yǎng)基用于計數(shù)T1E-18；添加50μg/mL鏈霉素和100μg/mL氨芐西林的固體LB培養(yǎng)基用于計數(shù)大腸桿菌K111。在30°C培養(yǎng)24小時后計數(shù)菌落，推算CFU/mL；每個實驗至少重復三次。
最低抑菌濃度（MIC）測定
根據(jù)臨床和實驗室標準協(xié)會的指南，采用兩倍系列稀釋法在含或不含300μM吲哚的液體LB培養(yǎng)基中進行MIC測定。使用的抗生素最高濃度如下：四環(huán)素10,000μg/mL、氯霉素3000μg/mL、諾氟沙星200μg/mL、紅霉素3000μg/mL和氨芐西林10,000μg/mL。每個測定至少進行三次獨立實驗，每個實驗設置三個重復；MIC定義為抑制菌株生長的最低抗生素濃度。
紙片擴散法抗生素敏感性測試
采用柯比-鮑爾法：在含或不含300μM吲哚的LB瓊脂平板上，涂布約10^8 CFU/mL的野生型惡臭假單胞菌DOT-T1E或其突變體菌株（惡臭假單胞菌T1E-18、T1E-PS28和T1E-PS32），形成菌苔；平板表面干燥后，將氧氟沙星（5μg）、培氟沙星（5μg）、阿莫西林（25μg）、替卡西林（75μg）、氨芐西林（10μg）、頭孢他啶（30μg）、氯霉素（30μg）、紅霉素（15μg）和四環(huán)素（30μg）的抗生素紙片放置在平板表面；在30°C培養(yǎng)18-20小時后，測量每個紙片周圍的抑菌圈直徑（mm）。在以大腸桿菌上清液作為吲哚來源的系列實驗中，將100 mL過濾后的培養(yǎng)上清液與50 mL 5%LB瓊脂混合并鋪板，實驗方法與添加純吲哚時相同。
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