3倍變化且p值<0.05）的順時(shí)針和逆時(shí)針?lè)较虻牡鞍踪|(zhì)。紅線表示在尼古丁培養(yǎng)基中上調(diào)的蛋白質(zhì)，藍(lán)線表示在甘油培養(yǎng)基中上調(diào)的蛋白質(zhì)。圓圈3和圓圈4指示使用COG數(shù)據(jù)庫(kù)分析的順時(shí)針和逆時(shí)針?lè)较虻念A(yù)測(cè)CDS（顏色根據(jù)COG功能類(lèi)的顏色代碼分配）；圓圈5指示S16基因組中預(yù)測(cè)的基因組島。紅線代表S16中最大的基因組島，其中尼古丁降解簇位于該圓圈中。圓圈6指示tRNA；圓圈7和圓圈8分別指示GC偏斜(G-C/G+C)值和GC含量百分比，使用4000-bp窗口大小和2000-bp重疊。[16]（圖2）。
從外向內(nèi)，圓圈1和圓圈2指示在尼古丁和甘油培養(yǎng)基中差異表達(dá)（>=3倍變化且p值<0.05）的順時(shí)針和逆時(shí)針?lè)较虻牡鞍踪|(zhì)。紅線表示在尼古丁培養(yǎng)基中上調(diào)的蛋白質(zhì)，藍(lán)線表示在甘油培養(yǎng)基中上調(diào)的蛋白質(zhì)。尼古丁暴露引起S16菌株蛋白質(zhì)組中與碳水化合物代謝相關(guān)的幾種蛋白質(zhì)豐度的變化（表S2）。NicA2(PPS_4081)、HspB(PPS_4061)(13)、Pnao(PPS_4080)[18]和Sapd(PPS_4079)在尼古丁條件下的豐度高于甘油條件，表明這些酶是尼古丁降解所必需的（表S2和圖3）。有趣的是，兩個(gè)最可能的尼古丁降解酶集(PPS_4077和PPS_4078)在尼古丁條件下顯著上調(diào)，使它們成為負(fù)責(zé)尼古丁降解的可能基因。尼古丁培養(yǎng)物中酶NicA1(PPS_0381)的表達(dá)量約為甘油培養(yǎng)物中的5倍。此外，蛋白質(zhì)HspA(PPS_0380)在尼古丁條件下的表達(dá)仍然與HspB(PPS_4061)不同，如先前報(bào)道[13]（圖3）。
尼古丁對(duì)惡臭假單胞菌S16膜蛋白質(zhì)組表達(dá)的影響
在尼古丁存在下上調(diào)的除降解酶以外的其他蛋白質(zhì)包括孔蛋白(PPS_4075)、主要協(xié)助子超家族代謝物同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PPS_4076)、TolC家族I型分泌外膜蛋白(PPS_3866)、抗性-結(jié)節(jié)化-細(xì)胞分裂(RND)外排系統(tǒng)外膜脂蛋白(PPS_3077)、RND家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，MFP亞基(PPS_2905)、TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子(PPS_1707)和假設(shè)蛋白(PPS_4370, PPS_3191)（表S2）。在1 g l-1尼古丁中培養(yǎng)惡臭假單胞菌S16細(xì)胞導(dǎo)致幾種外膜蛋白含量的改變，特別是孔蛋白和RND外排系統(tǒng)豐度的增加。PPS_4075的推導(dǎo)序列表明它是一種推定的外膜蛋白孔蛋白。這里鑒定的外膜孔蛋白的差異表達(dá)可能與適應(yīng)環(huán)境壓力有關(guān)。序列比對(duì)表明保守區(qū)域位于OprD中假定的跨膜結(jié)構(gòu)域上。發(fā)現(xiàn)RND外排系統(tǒng)外膜脂蛋白(PPS_3077)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(PPS_4740)、含TM螺旋重復(fù)蛋白(PPS_1651)和RND家族外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，MFP亞基(PPS_2905)在尼古丁暴露后增加?；騊PS_3077被提議為RND外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白外膜脂蛋白，它可能將有毒有機(jī)溶劑輸出到外部介質(zhì)[19]。該亞基的含量在尼古丁暴露后增加（表S2），表明該外排泵是S16菌株適應(yīng)尼古丁應(yīng)激所必需的。
基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的驗(yàn)證
為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)并評(píng)估與尼古丁降解相關(guān)或推測(cè)相關(guān)的基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平，我們利用RT-PCR和RT-qPCR比較了有或無(wú)尼古丁誘導(dǎo)下，惡臭假單胞菌S16中基因nicA2、pnao、sapd、mfs、spmA、spmC、porin、nicA1和hspA（推測(cè)與尼古丁降解相關(guān)）的mRNA水平（圖4）。RT-qPCR分析顯示，所有靶基因在尼古丁誘導(dǎo)的惡臭假單胞菌S16中似乎都上調(diào)。相對(duì)于非尼古丁誘導(dǎo)，在尼古丁誘導(dǎo)的惡臭假單胞菌S16中，與尼古丁降解途徑相關(guān)的基因的mRNA表達(dá)量高出18.8至90.3倍，其中nicA2的mRNA上調(diào)90.3倍是所測(cè)試基因中mRNA水平差異最大的。spmA和spmC的mRNA也分別上調(diào)了13.6倍和4.5倍（圖4A）。使用半定量RT-PCR也觀察到類(lèi)似的結(jié)果，這些基因中的每一個(gè)在尼古丁暴露后都被誘導(dǎo)，表明它們?cè)赟16菌株的尼古丁降解中起作用（圖4B）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明通過(guò)RT-qPCR確定的mRNA水平與通過(guò)2D LC-MS/MS測(cè)量的蛋白質(zhì)水平一致，并且差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄水平上受到調(diào)控。
新型尼古丁誘導(dǎo)蛋白SpmA、SpmB和SpmC的鑒定
2D LC-MS/MS和RT-qPCR分析顯示，spmA和spmC的蛋白質(zhì)和mRNA水平在尼古丁誘導(dǎo)的惡臭假單胞菌S16中高表達(dá)，并且spmA、spmB和spmC基因產(chǎn)物與一些黃嘌呤脫氫酶家族成員（節(jié)桿菌屬尼古丁vorans的尼古丁脫氫酶[20]，惡臭假單胞菌86的喹啉2-氧化還原酶[21]）的亞基顯示出顯著的序列同一性，表明這三個(gè)基因編碼來(lái)自惡臭假單胞菌S16的SP單加氧酶的三個(gè)亞基。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，通過(guò)在spmA中進(jìn)行極性單同源重組構(gòu)建了突變菌株惡臭假單胞菌S16dspm，并測(cè)量了其在尼古丁中的相關(guān)細(xì)胞生長(zhǎng)和靜息細(xì)胞對(duì)尼古丁的轉(zhuǎn)化。破壞spmABC基因（spmA、spmB和spmC）不允許惡臭假單胞菌S16dspm以尼古丁作為唯一碳源和氮源生長(zhǎng)（圖5A）。此外，惡臭假單胞菌S16dspm的靜息細(xì)胞將尼古丁完全轉(zhuǎn)化為SP，但不能再轉(zhuǎn)化SP，導(dǎo)致SP積累，而野生型惡臭假單胞菌S16的靜息細(xì)胞可以催化SP轉(zhuǎn)化為HSP（圖5B）。這些數(shù)據(jù)表明spmABC基因編碼將SP轉(zhuǎn)化為HSP的SP單加氧酶。為了更牢固地確立這一結(jié)論，將包含spmA ATG上游100 bp的片段spm100克隆并在穿梭質(zhì)粒pME6032-spm100中表達(dá)。當(dāng)質(zhì)粒pME6032-spm100轉(zhuǎn)移到惡臭假單胞菌S16dspm時(shí)，重組菌株獲得了以尼古丁作為唯一碳源和氮源生長(zhǎng)的能力（圖5C），并且也可以將SP轉(zhuǎn)化為HSP（圖5D和圖S2）。上述數(shù)據(jù)表明spmABC的產(chǎn)物是負(fù)責(zé)將SP羥基化為HSP的單加氧酶。
mfs(PPS_4076)和sapd(PPS_4079)的功能分析
使用pK18mob質(zhì)粒敲除編碼Mfs基因的PPS_4076。我們發(fā)現(xiàn)突變體S16dmfs生長(zhǎng)比野生型菌株S16差（圖S3）。mys基因的缺失表明該基因?qū)τ谡５哪峁哦〗到夂苤匾?。有趣的是，?dāng)基因sapd被敲除時(shí)，突變體S16dsapd比野生型菌株S16生長(zhǎng)慢。并且兩者都能在尼古丁平板上生長(zhǎng)良好（圖S4）。
相關(guān)新聞推薦
1、室溫條件下pH、aw及鹽分對(duì)腐敗希瓦氏菌生長(zhǎng)概率的交互影響（一）
2、A型塞內(nèi)卡病毒全長(zhǎng)感染性克隆、致病機(jī)理及生長(zhǎng)曲線分析（二）
3、假單胞菌屬有哪些？含有幾種細(xì)菌？為什么叫假單胞菌呢
4、福建特產(chǎn)糟制大黃魚(yú)發(fā)酵原料紅酒糟中短乳桿菌和釀酒酵母生長(zhǎng)曲線測(cè)定（二）