最小抑制濃度測(cè)量
四環(huán)素和環(huán)丙沙星的最小抑制濃度測(cè)定通過(guò)肉湯宏稀釋在10 mL管中進(jìn)行。含Mueller-Hinton肉湯(1 mL)補(bǔ)充不同濃度抗生素的管接種1μL 37°C過(guò)夜細(xì)菌培養(yǎng)物。管在37°C振蕩孵育16至18小時(shí)，四環(huán)素培養(yǎng)物避光防止抗生素降解。最小抑制濃度設(shè)定為無(wú)可見(jiàn)生長(zhǎng)的最低抗生素濃度。鏈霉素最小抑制濃度通過(guò)Etest根據(jù)制造商說(shuō)明（AB bioMerieux,Solna,Sweden）測(cè)定。Etest在Mueller-Hinton瓊脂板上進(jìn)行，37°C孵育16-18小時(shí)。
競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)
有限采樣競(jìng)爭(zhēng)者（<10^3細(xì)胞）常在競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中引入統(tǒng)計(jì)不確定性，更準(zhǔn)確的耐藥突變體與野生型細(xì)胞比例測(cè)量可通過(guò)染色體拷貝青色(cfp)或黃色(yfp)變體綠色熒光蛋白基因(gfp)輔助獲得。這些允許使用熒光激活細(xì)胞分選器追蹤大量單細(xì)胞(10^5細(xì)胞)。cfp/yfp基因使用λRed系統(tǒng)如前描述插入galK，并通過(guò)噬菌體P22轉(zhuǎn)導(dǎo)或噬菌體P1轉(zhuǎn)導(dǎo)移動(dòng)到各種菌株。
過(guò)夜在Mueller-Hinton培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的敏感野生型菌株與cft或yft之一混合1:1、10:1、10^2:1、10^3:1和10^4:1與攜帶另一標(biāo)記的同基因耐藥突變體，并通過(guò)每24小時(shí)1000倍系列稀釋（導(dǎo)致每次傳代10代生長(zhǎng)）維持長(zhǎng)達(dá)4至6次系列傳代。群體中耐藥與敏感細(xì)胞比例在每次系列傳代通過(guò)使用熒光激活細(xì)胞分選器(BD FacsAria)計(jì)數(shù)10^5細(xì)胞確定。選擇系數(shù)使用回歸模型確定，如前描述，其中R是耐藥與敏感比例。此方案允許可重復(fù)測(cè)定小至s=0.003的適應(yīng)性差異。還包括兩套獨(dú)立構(gòu)建的每個(gè)野生型菌株，標(biāo)記有cfp或yfp，以測(cè)量有cfp標(biāo)記相對(duì)于yfp標(biāo)記對(duì)生長(zhǎng)速率的相對(duì)影響。這些對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示超過(guò)40代競(jìng)爭(zhēng)，標(biāo)記間成本差異對(duì)生長(zhǎng)速率影響可忽略。以低初始比例耐藥突變體進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)使用四環(huán)素進(jìn)行，因新發(fā)四環(huán)素耐藥突變體出現(xiàn)所需時(shí)間長(zhǎng)可能干擾競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。
新發(fā)進(jìn)化耐藥突變體的富集
為調(diào)查亞抑制抗生素濃度是否也可以選擇新發(fā)耐藥突變體，敏感細(xì)菌在鏈霉素最小抑制濃度的1/4和環(huán)丙沙星最小抑制濃度的1/10下系列傳代?？偣?0個(gè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌LT2獨(dú)立譜系通過(guò)每24小時(shí)在含1μg/ml鏈霉素的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中1 mL批量培養(yǎng)1000倍稀釋系列傳代700代（每次傳代10代生長(zhǎng)），和20個(gè)大腸桿菌MG1655獨(dú)立譜系通過(guò)每24小時(shí)在含2.3 ng/ml環(huán)丙沙星的Mueller-Hinton培養(yǎng)基中1 mL批量培養(yǎng)1000倍稀釋系列傳代600代。譜系從獨(dú)立菌落過(guò)夜培養(yǎng)物開(kāi)始，使用約10^4細(xì)胞初始瓶頸以最小化預(yù)存耐藥突變體數(shù)量。每個(gè)培養(yǎng)物中耐藥細(xì)胞百分比通過(guò)每100代鋪板約10^5細(xì)胞到含不同濃度抗生素的LB瓊脂上并計(jì)數(shù)菌落數(shù)監(jiān)測(cè)。這些細(xì)胞子集在同一抗生素濃度上重新劃線以確認(rèn)耐藥性。
結(jié)果
初始檢查低抗生素濃度效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)在單一培養(yǎng)中進(jìn)行，其中敏感野生型和攜帶Tn10dTet的耐藥突變體分別在四環(huán)素不同濃度下生長(zhǎng)。如圖1B所示，遠(yuǎn)低于敏感最小抑制濃度的濃度降低了敏感菌株的指數(shù)生長(zhǎng)速率，而對(duì)耐藥菌株無(wú)明顯影響。例如，在敏感最小抑制濃度1/30的濃度下，敏感菌株生長(zhǎng)比無(wú)抗生素時(shí)慢約15%，而耐藥突變體似乎未受影響，表明耐藥菌株在這些低濃度下被強(qiáng)烈選擇。為提高測(cè)定靈敏度并檢測(cè)極微小的生長(zhǎng)速率差異，我們進(jìn)行了敏感和耐藥菌株對(duì)之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。
敏感和耐藥突變體的最小抑制濃度為：鼠傷寒沙門(mén)氏菌野生型（鏈霉素=4μg/ml，四環(huán)素=1.5μg/ml），rpsL K42R>1024μg/ml和Tn10dTet菌株=128μg/ml；大腸桿菌野生型（環(huán)丙沙星=0.023μg/ml），gyrA S83L（環(huán)丙沙星=0.38μg/ml），gyrA D87N（環(huán)丙沙星=0.25μg/ml），ΔacrR（環(huán)丙沙星=0.047μg/ml）和ΔmarR（環(huán)丙沙星=0.047μg/ml）。菌株通過(guò)綠色熒光蛋白基因變體（yfp和cfp，分別編碼黃色和青色熒光蛋白）進(jìn)行遺傳標(biāo)記，允許通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選計(jì)數(shù)大群體競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞，從而顯著減少與小群體計(jì)數(shù)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)誤差。競(jìng)爭(zhēng)菌株除耐藥決定子和產(chǎn)生各自熒光蛋白的yfp和cfp基因外為同基因。對(duì)照實(shí)驗(yàn)顯示cfp和yfp標(biāo)記之間的適應(yīng)性成本差異對(duì)生長(zhǎng)速率影響可忽略。
圖1. 抗生素濃度對(duì)生長(zhǎng)速率的影響。(A) 抗生素濃度與生長(zhǎng)速率關(guān)系的示意圖。綠色區(qū)域表示敏感菌株（藍(lán)色曲線）將勝過(guò)耐藥菌株（紅色曲線）的濃度區(qū)間。橙色（亞MIC選擇窗口）和紅色（傳統(tǒng)突變體選擇窗口）分別表示耐藥菌株將勝過(guò)敏感菌株的濃度區(qū)間。其中，MICsusc為敏感菌株的最低抑菌濃度，MICres為耐藥菌株的最低抑菌濃度，MSC為最低選擇濃度。(B) 腸炎沙門(mén)氏菌敏感株（空心圓）與耐藥株（實(shí)心圓）在四環(huán)素濃度下的相對(duì)指數(shù)生長(zhǎng)速率。圖中標(biāo)注了均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。相對(duì)生長(zhǎng)速率1.0對(duì)應(yīng)約1.8小時(shí)21。實(shí)驗(yàn)在37°C的穆勒-欣頓培養(yǎng)基中進(jìn)行。
菌株在批量培養(yǎng)中通過(guò)系列傳代在四環(huán)素、環(huán)丙沙星（一種氟喹諾酮）和鏈霉素（一種氨基糖苷類）的不同濃度下或無(wú)藥物下競(jìng)爭(zhēng)長(zhǎng)達(dá)80代（圖2A-D，圖3A-H，圖4A-E）。如我們先前研究所示，此實(shí)驗(yàn)設(shè)置允許檢測(cè)至少小至0.3%的生長(zhǎng)速率差異，接近周期性選擇事件干擾設(shè)定的靈敏度極限。而圖1B所示的生長(zhǎng)速率測(cè)量?jī)H測(cè)量指數(shù)生長(zhǎng)期，競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)代表滯后相、指數(shù)相和靜止相生長(zhǎng)和存活的復(fù)合體，允許檢查整個(gè)生長(zhǎng)周期。
圖2. 易感菌株與抗性菌株、鏈霉素與四環(huán)素之間的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。不同抗生素濃度（A（rpsL105（K42R））和 C（Tn10dtet））下的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，以及計(jì)算的選擇系數(shù)隨抗生素濃度的變化（B 和 D）。圖 A 和 C 均基于單次競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)（四次實(shí)驗(yàn)的平均值），而圖 B 和 D 則根據(jù)多達(dá) 20 次競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)的選擇系數(shù)計(jì)算得出。均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差已標(biāo)出。
圖2A、C、圖3A、C、E、G和圖4A-D所示數(shù)據(jù)展示了耐藥:敏感菌株比例隨生長(zhǎng)代數(shù)在不同抗生素濃度下的變化。每條線代表一次競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，斜率是選擇系數(shù)（s值）的度量。因此，無(wú)抗生素時(shí)獲得的負(fù)斜率是抗生素耐藥機(jī)制適應(yīng)性成本的度量，正斜率表明耐藥突變體被富集。當(dāng)從這些實(shí)驗(yàn)獲得的s值繪制為抗生素濃度函數(shù)時(shí)，截距s=0代表我們指定的最小選擇濃度（MSC），其中耐藥性的適應(yīng)性成本與抗生素對(duì)耐藥突變體的選擇相平衡（圖2B、D，圖3B、D、F、H和圖4E）。
圖3. 敏感菌株與耐藥菌株在環(huán)丙沙星中的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)。圖中展示了不同濃度環(huán)丙沙星（A（gyrA2（D87N））、C（gyrA1（S83L））、E（DacrR）和G（DmarR））的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以及抗生素濃度對(duì)選擇系數(shù)的影響（B、D、F和H）。其中圖A、C、E、G基于單次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)（三次實(shí)驗(yàn)的平均值），而圖B、D、F、H則根據(jù)六次實(shí)驗(yàn)的選擇系數(shù)計(jì)算得出。圖中均標(biāo)注了均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
取決于抗生素和檢查的耐藥突變類型，MSC在敏感最小抑制濃度的1/4至1/230之間變化。對(duì)于鏈霉素，MSC值為敏感菌株最小抑制濃度的1/4（圖2B），對(duì)于四環(huán)素為1/100（圖2D），對(duì)于環(huán)丙沙星，根據(jù)特定耐藥突變，在敏感最小抑制濃度的1/10（圖3B）至1/230（圖3D）之間變化。這些值對(duì)應(yīng)絕對(duì)抗生素濃度1μg/ml（鏈霉素）、15 ng/ml（四環(huán)素）和2.5 ng/ml至100 pg/ml（環(huán)丙沙星）。以低初始比例耐藥突變體進(jìn)行的競(jìng)爭(zhēng)也顯示選擇系數(shù)與耐藥突變體初始頻率無(wú)關(guān)。即使初始頻率低至10??，也能觀察到與1:1比例相同的耐藥突變體富集（即相同選擇系數(shù)）（比較圖2D和圖4E）。
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