2結果
2.1細胞病變
接毒12 h后即可觀察到CPE，在48 h時最明顯，主要細胞病變?yōu)榧毎s、破碎，脫落，成團，邊緣不清晰，個別胞體出現(xiàn)變大，死亡等特征，對照組細胞生長良好(圖1)。
A.正常；B.接毒后24 h；C.接毒后48 h；D.接毒后72 h
圖1 DF1細胞形態(tài)(400×)
2.2 RT-PCR檢測結果
收取接種ARV S1133株的第3代DF1細胞培養(yǎng)物，用RT-PCR檢測。結果擴增到一條1 248 bp大小片段(圖2)。對片段序列與所選的參考株同源性在99.99%以上，說明ARV S1133毒株在DF1細胞上增殖。
2.3 ARV S1133毒株在DF1細胞系上的增殖規(guī)律
ARV S1133接種DF1細胞后，分別收取12、24、36、48、72、96、120 h的細胞培養(yǎng)物，測其TCID50，每個時間點分別做3次重復試驗，取平均值。7個時間點的TCID50平均值分別為10-2.49、10-3.5、10-6.84、10-8.9、10-7.86、10-5.38、10-3.64，繪制出生長曲線(圖3)。該曲線顯示，ARV接種DF1細胞后，0～12 h為靜止期，12 h～48 h為快速增長期，在48 h達到最大的病毒效價，TCID50為10-8.9/0.1 mL。
M.DNA標準DL 2 000;1.PCR擴增產(chǎn)物；2.陰性對照
圖2 ARV RT-PCR檢測結果
圖3 ARV S1133在DF1細胞上的生長曲線
3討論
隨著養(yǎng)禽業(yè)的快速發(fā)展，禽病發(fā)生日益增多。近年來，多省份陸續(xù)有ARV感染疫情的發(fā)生，報道指出ARV有更廣的宿主范圍，更強的致病性，流行的疫區(qū)也日漸擴大，是一種嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重要傳染病。目前，分離ARV一般采用雞胚接種，此法雖然單次獲毒較多，但需要的時間長，且操作繁瑣，在快速獲取大量病毒方面不具有時效性，在一定程度上反而限制了ARV的分離。DF1細胞系來源于ELL雞胚胎，該細胞無禽白血病病毒、肉瘤病毒內(nèi)源性基因，同時在形態(tài)上呈纖維狀，是一種穩(wěn)定的、無腫瘤基因、自發(fā)無限增殖的細胞系。目前被廣泛用于動物病毒研究、疫苗研制、癌癥研究等諸多領域，是生命科學領域重要的病毒轉染、培養(yǎng)生物材料。ARV基因組為RNA，而DF1細胞可用于反轉錄病毒的復制，DF1細胞系有助于ARV對細胞殺傷力的研究。為此，采用了細胞增殖病毒的方法，研究了ARV S1133毒株在DF1細胞上的增殖特性，大大縮短了獲取大量病毒的時間，大幅提高了獲毒效率。
定量描述病毒生長規(guī)律的實驗曲線稱為一步生長曲線，根據(jù)病毒的生長特點可劃分為靜止期、快速增長期、穩(wěn)定期3個時期。通常用來研究病毒在細胞上的增殖規(guī)律的方法主要有測定病毒的TCID50和病毒蝕斑試驗。本研究直接采取了測定病毒TCID50的方法，并用PCR檢測、測序確定細胞僅有ARV感染，無其他病原污染。試驗結果顯示，ARV接種DF1細胞后，前24 h為靜止期，24 h后進入快速增長期，并在48 h達到最大的病毒效價，即TCID50為10-8.9/0.1 mL。這一增殖規(guī)律可能與細胞的自身免疫機制有關，至于真正的原因，還待進一步的研究。本研究結果表明，ARV可在DF1細胞上有效地增殖，并伴有典型病變，在接毒48 h后出現(xiàn)病毒效價峰值，TCID50為10-8.9/0.1 mL。ARV感染DF1細胞的最佳收毒時間為接毒后的48 h。本研究結果可為下一步用DF1細胞研制ARV滅活苗及致病機理研究奠定基礎。
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