1.2.3 CA活性檢測(cè)
CA活性檢測(cè)參照劉璐等的方法，略作改進(jìn)。采用酶標(biāo)儀在400 nm處檢測(cè)對(duì)硝基苯酚（p-NP）濃度，并作其隨時(shí)間變化曲線，計(jì)算CA活性。①繪制對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線；②工作液的制備：0.02 mmol/L乙酸對(duì)硝基苯酯（p-NPA）溶于1 mL無水乙醇，0.02 mmol/L二乙基丙二酸溶于9 mL磷酸緩沖溶液，將兩者混合均勻；③粗酶液制備：取5 mL菌懸液10 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋2倍后，與工作液1:1混合，制成胞外CA酶液；取5 mL菌懸液與1 mL B-PER?Bacterial Cell Lysis Reagents混合均勻，靜置30 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋2倍后，與工作液1:1混合，制成總CA酶液；④酶活性檢測(cè)：將粗酶液放入酶標(biāo)檢測(cè)盒中，25℃反應(yīng)3 min后測(cè)定OD???；⑤利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出生成p-NP的濃度，計(jì)算CA活性。酶活性定義：每毫升每分鐘內(nèi)生成1μmol p-NP所需的酶量，單位：U/mL。
1.2.4培養(yǎng)基初始pH對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
用5 mol/L NaOH溶液與1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基初始pH值分別至6.0、7.0、8.0、9.0。以2%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的接種量將菌懸液（OD???=0.5）接至100 mL液體培養(yǎng)基中，置于30℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測(cè)菌液OD???，12、24、36、60、84 h檢測(cè)CA活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。
1.2.5接種量對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
以1%、2%、4%、8%的接種量分別將菌懸液接至100 mL液體培養(yǎng)基（pH=7.0）中，置于30℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測(cè)菌液OD???，12、24、36、60、84 h檢測(cè)CA活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。
1.2.6溫度對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
以2%的接種量將菌懸液接至100 mL液體培養(yǎng)基（pH=7.0）中，分別置于20、25、30、35、40、45、50和60℃、150 r/min的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測(cè)菌液OD???，12、24、36、60、84 h檢測(cè)CA活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。
1.2.7轉(zhuǎn)速對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
以2%的接種量將菌懸液接至100 mL液體培養(yǎng)基（pH=7.0）中，分別置于120、150、180 r/min、45℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。分別于4、8、12、24、36、60、84 h檢測(cè)菌液OD???，12、24、36、60、84 h檢測(cè)CA活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。
1.2.8金屬離子對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
設(shè)定Zn2?、Co2?、Cd2?、Mn2?、Mg2?、Ca2?等金屬離子濃度梯度為0.005、0.010、0.020 mmol/L。以2%的接種量將菌懸液接入含不同濃度金屬離子的100 mL液體培養(yǎng)基（pH=7.0）中，置于150 r/min、45℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)60 h后檢測(cè)CA活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。
1.2.9最佳培養(yǎng)條件下B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA特性
以2%的接種量將菌懸液接至100 mL含0.010 mmol/L Mn2?的液體培養(yǎng)基（pH=7.0）中，置于150 r/min、45℃的恒溫?fù)u床中培養(yǎng)。定期取樣檢測(cè)菌液OD???和CA活性。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。
2結(jié)果與分析
2.1對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
配制不同濃度p-NP溶液（0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L），在波長(zhǎng)400 nm下測(cè)定其吸光度，結(jié)果見圖1。
圖1對(duì)硝基苯酚標(biāo)準(zhǔn)曲線圖
2.2培養(yǎng)基初始pH對(duì)B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA的影響
不同初始pH條件下，B.safensis生長(zhǎng)及其產(chǎn)CA活性變化如圖2所示。初始pH在6.0~9.0范圍內(nèi)，其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)幾乎無影響，說明該菌株對(duì)弱酸和弱堿性環(huán)境均有一定的耐受性。初始pH值為7.0時(shí)，菌液OD???值最高，為3.97。初始pH對(duì)CA活性的影響較為明顯。在不同初始pH條件下，CA活性均隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈先增長(zhǎng)后降低的趨勢(shì)，并在60 h左右達(dá)到峰值，其中初始pH值為7.0時(shí)酶活最高，為0.182 U/mL。Zheng等報(bào)道，初始pH值為8.0時(shí)，膠凍樣芽胞桿菌產(chǎn)CA的活性最高，但在7.0~9.0范圍內(nèi)，酶活變化不大。本研究表明，B.safensis產(chǎn)CA最適的初始pH值為7.0，這可能與細(xì)菌種類、培養(yǎng)基組份不同而導(dǎo)致培養(yǎng)后期pH值存在差異有關(guān)。
圖2培養(yǎng)基初始pH對(duì)B.safensis生長(zhǎng)與CA活性的影響
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