甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶具有將甘露糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸的能力，是糖酵解途徑的中間體，甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶在糖代謝中發(fā)揮著重要作用。然而甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶在大腸桿菌不同碳源代謝過程中發(fā)揮的功能目前未見報(bào)道。
本研究采用二型內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄突變方法構(gòu)建manA基因突變大腸桿菌，分析manA基因突變菌株對碳源的利用情況以及對大腸桿菌糖代謝途徑關(guān)鍵基因表達(dá)的影響，以探討甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶對大腸桿菌糖代謝的影響。
不同碳源培養(yǎng)基中大腸桿菌生長曲線測定
將大腸桿菌BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA以108CFU/mL的初始接菌量接種于含1%不同碳源（甘露糖、果糖、葡萄糖、淀粉）的LB液體培養(yǎng)基中，在微生物比濁法測定儀上37℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。每間隔2 h檢測菌液OD600值，繪制生長曲線。
BL21（DE3）ΔmanA在甘露糖培養(yǎng)基中的生長曲線
大腸桿菌BL21（DE3）ΔmanA和BL21（DE3）在含甘露糖LB液體培養(yǎng)基中的生長曲線如圖1所示。在0～2 h內(nèi)，BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA的生長曲線相似，細(xì)胞生長無顯著性差異性（P＜0.05）。與BL21（DE3）菌株相比，BL21（DE3）ΔmanA菌株在4～12 h時(shí)細(xì)胞生長能力下降，生長趨勢明顯低于BL21（DE3）（P＜0.05）。當(dāng)進(jìn)入穩(wěn)定期，BL21（DE3）ΔmanA菌株的光密度顯著低于BL21（DE3）菌株（P＜0.05），表明manA基因的突變顯著影響大腸桿菌對甘露糖的利用，導(dǎo)致突變菌株的生長能力下降。
BL21（DE3）ΔmanA在果糖培養(yǎng)基的中生長曲線
如圖2所示，0～4 h內(nèi)，BL21（DE3）和BL21（DE3）ΔmanA菌株的生長無顯著性差異（P＜0.05）；6～12 h，BL21（DE3）ΔmanA菌株的細(xì)胞生長能力顯著性低于BL21（DE3）（P＜0.05），對果糖的利用率低。
BL21（DE3）ΔmanA菌株在葡萄糖培養(yǎng)基中的生長曲線
如圖3所示，當(dāng)BL21（DE3）ΔmanA菌株在含葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，BL21（DE3）ΔmanA菌株在對數(shù)期和穩(wěn)定期對葡萄糖的利用與對照菌株BL21（DE3）無顯著性差異（P＜0.05），表明編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因的突變不影響大腸桿菌對葡萄糖的利用。
BL21（DE3）ΔmanA菌株在淀粉培養(yǎng)基中的生長曲線
在以淀粉為碳源的LB液體培養(yǎng)基中生長時(shí)，0～2 h，BL21（DE3）ΔmanA菌株和BL21（DE3）對淀粉的利用沒有顯著性變化（P＜0.05）。在4～12 h，BL21（DE3）ΔmanA菌株快速利用淀粉并加速細(xì)胞的生長，使得BL21（DE3）ΔmanA菌株對淀粉的利用顯著高于BL21（DE3）（P＜0.05），說明manA基因突變導(dǎo)致大腸桿菌對淀粉的利用率提高。
圖1 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在甘露糖-LB中的生長曲線
圖2 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在果糖-LB中的生長曲線
圖3 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在葡萄糖-LB中的生長曲線
圖4 BL21（DE3）ΔmanA菌株與BL21（DE3）在淀粉-LB中的生長曲線
結(jié)論
采用II型內(nèi)含子逆轉(zhuǎn)錄突變方法成功構(gòu)建manA基因突變菌BL21（DE3）ΔmanA。通過研究BL21（DE3）ΔmanA菌株和野生型大腸桿菌的糖代謝吸收及糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)以甘露糖和果糖為碳源時(shí)，菌株生長受到顯著抑制；而以淀粉為碳源時(shí)，BL21（DE3）ΔmanA菌株的生長明顯優(yōu)于野生型大腸桿菌；當(dāng)以葡萄糖為碳源時(shí)，manA基因突變對大腸桿菌生長無顯著影響。進(jìn)一步研究糖代謝基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BL21（DE3）ΔmanA菌株中甘露糖代謝相關(guān)基因（manX，manY，manZ）的表達(dá)顯著性降低；果糖代謝途徑中6-磷酸果糖激酶I亞基的編碼基因（pfkA）的表達(dá)顯著降低；水解淀粉的α-淀粉酶的編碼基因（malS）的表達(dá)顯著性增高。結(jié)果表明manA基因突變影響大腸桿菌甘露糖、果糖和淀粉代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響大腸桿菌對碳源（甘露糖、果糖、淀粉）的利用。
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