材料與方法


細(xì)菌菌株、質(zhì)粒和生長(zhǎng)條件。本研究中使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒列于表1。


表1：本研究中使用的細(xì)菌菌株和質(zhì)粒
菌株或質(zhì)粒 基因型或描述 來源或參考文獻(xiàn)
菌株
S. maltophilia ATCC 13637 野生型菌株 CGMCC
E.coli DH5α 用于分子克隆的宿主菌株 實(shí)驗(yàn)室收藏
E. coli BL21(DE3) 用于蛋白質(zhì)表達(dá)的宿主菌株 實(shí)驗(yàn)室收藏
SM004-SM055 (共51個(gè)菌株) D0107-04627 (共51個(gè)菌株)，通過pK18mob載體整合構(gòu)建的嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637組氨酸激酶基因插入突變體； Kanr 本研究
SM056 IFD-bfmA, bfmA (Smlt4209) 框內(nèi)缺失突變體 本研究
SM057 IFD-bfmK, bfmK (Smlt4208) 框內(nèi)缺失突變體 本研究
SM058 IFD-bfmA-bfmA, IFD-bfmA的互補(bǔ)菌株，含有pBBRMCS2:::bfmA載體； Kanr 本研究
SM059 IFD-bfmK-bfmK, IFD-bfmK的互補(bǔ)菌株，含有pBBRMCS2:::bfmK載體； Kanr 本研究
SM060 IFD-bfmA-bfmA*, 類似于SM059，但在bfmA的3'端帶有His6編碼序列，用于ChIP分析； Kanr 本研究
SM061 IFD-acoT, acoT (Smlt0800) 框內(nèi)缺失突變體 本研究
SM062 IFD-acoT-acoT, IFD-acoT的互補(bǔ)菌株，含有pBBRMCS2::acoT載體； Kanr 本研究
SM063 IFD-bfmA-acoT, 含有pBBRMCS2::acoT載體的菌株IFD-bfmA，用于上位性分析； Kanr 本研究
質(zhì)粒
pK18mob 通過單交換創(chuàng)建突變體的自殺載體； Kanr Schafer et al. (40)
pK18mobsacB 通過雙交換創(chuàng)建突變體的自殺載體； Kanr Schafer et al. (40)
pET30a 蛋白質(zhì)表達(dá)載體； Kanr Novagen
pBBR1MCS2 用于遺傳互補(bǔ)的廣宿主范圍載體 實(shí)驗(yàn)室收藏
pBBR-4208 pBBR1MCS2::Smlt4208, bfmK突變體的遺傳互補(bǔ)載體； Kanr 本研究
pBBR-4209 pBBR1MCS2::Smlt4209, bfmA突變體的遺傳互補(bǔ)載體； Kanr 本研究
pBBR-0800 pBBR1MCS2::Smlt0800, acoT突變體的遺傳互補(bǔ)載體； Kanr 本研究
pET30a-4209 pET30a:Smlt4209, 用于BfmA表達(dá)； Kanr 本研究
pET28a-4208 pET28a:::Smlt4208, 用于BfmK表達(dá)； Kanr 本研究
嗜麥芽窄食單胞菌ATCC 13637在28°C的NYG培養(yǎng)基（5克/升胰蛋白胨，3克/升酵母提取物，20克/升甘油；pH 7.0）中培養(yǎng)。嗜麥芽窄食單胞菌感受態(tài)細(xì)胞通過在210培養(yǎng)基（4克/升酪蛋白酶解物，5克/升蔗糖，3克/升K?HPO?，0.3克/升MgSO?·7H?O；pH 7.0）中培養(yǎng)細(xì)菌制備；細(xì)胞通過離心（12,000×g）收集，并用冰冰冷甘油（10%）洗滌三次。用于分子克隆的大腸桿菌DH5α細(xì)胞通常在37°C的Luria-Bertani培養(yǎng)基中培養(yǎng)?？股厥褂靡韵聺舛龋嚎敲顾?，50微克/毫升；氨芐青霉素，100微克/毫升；壯觀霉素，100微克/毫升；鏈霉素，200微克/毫升。通過電穿孔（18和200Ω）使用Bio-Rad pulser Xcell電穿孔系統(tǒng)（Bio-Rad,USA）實(shí)現(xiàn)嗜麥芽窄食單胞菌和大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。



分子克隆和細(xì)菌菌株的遺傳操作。使用自殺載體pK18mob和pK18mobsacB分別通過同源單交換方法和同源雙交換方法構(gòu)建嗜麥芽窄食單胞菌的插入失活突變體和框內(nèi)缺失突變體，如前所述。用于擴(kuò)增相關(guān)DNA序列的引物列于表2。插入失活突變體在含有卡那霉素的NYG平板上篩選，框內(nèi)缺失突變體在含有10%蔗糖的NYG平板上篩選。為了構(gòu)建點(diǎn)突變，根據(jù)產(chǎn)品手冊(cè)使用Fast Mutagenesis System（Transgene,China）。常用的分子克隆方法，如PCR、連接和DNA限制性內(nèi)切酶消化，按照《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)》中的說明進(jìn)行。

表2：本研究中使用的引物
引物 序列 (5'→3') 用途
IFD4208 GAATTCTGCGGAAGCCCTGGTGCA 構(gòu)建bfmK框內(nèi)缺失突變體
GGATCCGAGCCAGTCACTGGCACTGC
GGATCCATCGCCGAGGGCGACCGA
AAGCTTGATCAGGGCATGGTGCTTGG
C4208 AAGCTTATGCTGGCCCTGGCCAGC 用于bfmK互補(bǔ)
GAATTCTCAGGTGAACTTTCCCAGCAG
P4208 CCATGGATCTGGCCCTGGCCAGCCTG 用于BfmK表達(dá)
AAGCTTGGTGAACTTTCCCAGCAGCAG
H237A GCTGCAGTGGCGGCAGACCTGCGC 構(gòu)建BfmK(H237A)
TGCCGCCACTGCAGCCAGCATATG
IFD4209 GAATTCGGAGAAATCGGAACGCCAGC 構(gòu)建bfmA框內(nèi)缺失突變體
GGATCCCAGCAGCACGTCCAGCGC
GGATCCGGGCAGGCCTCACCCGGT
AAGCTTTGCCCTGTGGTGGCGCAT
C4209 GGTACCATGACAACTCCCGCCCGT 用于bfmA互補(bǔ)
AAGCTTTCACAGCACCTGTACCTCGGC
P4209 CATATGACAACTCCCGCCCGTGTC 用于BfmA表達(dá)
AAGCTTCAGCACCTGTACCTCGGCG
D55A GACGTGATCATCATCCTCGCGTGGATGATG 構(gòu)建BfmA(D55A)
CGCGAGGATGATCACGTCCGGGCGATC
His4209 GGTACCATGACAACTCCCGCCCGT 構(gòu)建用于ChIP分析的菌株
AAGCTTTCAGTGGTGGTGGTGGTGCAGCACCTGTACCTCGGC
PR4209 CGGCAGGATGTGTTCGGGAG 用于EMSA，PSmlt4209探針
GCAGGCAGTATCAGGCAGG
IFD0800 AAGCTTATGCGCAAGACGGGATGG 構(gòu)建acoT框內(nèi)缺失突變體
GGATCCGGTTTTCGACTGCTGCCT
GGATCCGCCTATCGCCAGCGCCTGG
GAATTCTCAGAGCAGCGGCCTGAG
C0800 AAGCTTATGCGCAAGACGGGATGG 用于acoT突變體互補(bǔ)
GAATTCTCAGAGCAGCGGCCTGAG
P0800 CGATGGCCACGCTGGTGCCT 用于EMSA，PSmlt0800探針
TGGAGTCTCCTCATCGACAG
Q0570 GAAGTGGAGCTGGGCGAAAG 用于RT-PCR，Smlt0570
GGACGCATCGTCTGGATGTAC
Q0800 AAAAGCCGACCGTGGTAGTGA 用于RT-PCR，Smlt0800
GTTGGGCGGCACGTCAAT
Q0978 AACGCTGACCCGCGAAGT 用于RT-PCR，Smlt0978
TGGTCGTTGGCGAACACG
Q3568 GAGCTGCCGGACAAGATTGC 用于RT-PCR，Smlt3568
ATCCAGCACCAGATCGCCCACC
Q3949 ACCTGGGCAAACCATTCGA 用于RT-PCR，Smlt3949
TCCAGCAGCCGGTATTCG
Q4208 GCGGGTCGGTGTACTGAAGG 用于RT-PCR，bfmK
ATCGGCCAAGCGTCGTAG
Q4209 ATGACGACTCCCGCCCGT 用于RT-PCR，bfmA
CGACCTGCAGCAGCACGTC

表型表征。觀察在NYG平板上培養(yǎng)24小時(shí)的細(xì)菌菌落形態(tài)。在豐富NYG培養(yǎng)基和有氧條件下的細(xì)菌生長(zhǎng)通過自動(dòng)化微生物生長(zhǎng)曲線分析系統(tǒng)Bioscreen C（Oy Growth Curves Ab Ltd.,USA）測(cè)量。對(duì)于細(xì)菌游動(dòng)性測(cè)定，將菌株用牙簽接種到含有0.1%NYG的半固體瓊脂中，并在28°C培養(yǎng)12小時(shí)，測(cè)量游動(dòng)區(qū)的直徑。對(duì)于生物膜定量，使用先前報(bào)道的結(jié)晶紫染色法。將嗜麥芽窄食單胞菌培養(yǎng)物定量接種到96孔聚苯乙烯板的NYG培養(yǎng)基中，板在28°C靜置培養(yǎng)5小時(shí)。同時(shí)，通過酶標(biāo)儀（Tecan Infinite 200 Pro）在600納米波長(zhǎng)下測(cè)量板中細(xì)菌生長(zhǎng)的光密度值（OD???）。在染色前用水沖洗板中的孔，然后用結(jié)晶紫（1%）染色20分鐘，再?zèng)_洗。接著，用無水乙醇溶解結(jié)晶紫染色劑，并在酶標(biāo)儀上測(cè)量590納米波長(zhǎng)下的生物膜量（n=8）。


RT-PCR和實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定。使用TRIzol（Invitrogen,USA）提取細(xì)菌總RNA，并用NanoDrop分光光度計(jì)（Thermo Fisher,USA）定量。接著，使用DNA-free DNase（Life Technologies）純化提取的RNA以去除任何污染的DNA。使用隨機(jī)引物（Promega,USA）和Superscript III逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）（Invitrogen,USA）從純化的RNA合成cDNA。包括嗜麥芽窄食單胞菌DNA模板作為PCR的陽性對(duì)照，轉(zhuǎn)移信使RNA（tmRNA）擴(kuò)增用作RT-PCR的加樣對(duì)照；在cDNA合成過程中缺少逆轉(zhuǎn)錄酶的樣品作為陰性對(duì)照，以評(píng)估潛在的DNA污染。用于擴(kuò)采樣基因的引物列于表2。


蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和磷酸化測(cè)定。使用pET28a和pET30a（Novagen）表達(dá)載體分別在大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中表達(dá)重組BfmA-His?和BfmK-His?蛋白。用于構(gòu)建重組載體的PCR引物列于表2。BfmA-His?通過Ni-次氮基三乙酸（NTA）親和層析純化，根據(jù)制造商手冊(cè)（Novagen）。BfmK HK的反向膜囊泡根據(jù)我們先前研究中使用的方法制備。純化的蛋白質(zhì)和反向膜囊泡儲(chǔ)存在儲(chǔ)存緩沖液（50 mM Tris-HCl,0.5 mM EDTA,50 mM NaCl,5%甘油；pH 8.0）中。


我們按照先前使用的方法進(jìn)行體外磷酸化測(cè)定。簡(jiǎn)而言之，對(duì)于自動(dòng)磷酸化測(cè)定，將BfmK反向膜囊泡在20微升體積的自動(dòng)磷酸化緩沖液（50 mM Tris-HCl[pH 7.8],2 mM二硫蘇糖醇[DTT],25 mM NaCl,25 mM KCl,5 mM MgCl?）中與含有10微居里[γ-32P]ATP（PerkinElmer）的100微摩爾ATP在28°C孵育10分鐘。為了檢測(cè)BfmK和BfmA之間的磷酸轉(zhuǎn)移，將20微摩爾純化的可溶性BfmA加入反應(yīng)混合物中，然后在28°C孵育圖4中指定的時(shí)間。通過加入6X SDS-PAGE上樣緩沖液終止反應(yīng)。然后將磷酸化的蛋白質(zhì)在12%SDS-PAGE凝膠上分離。電泳后，將凝膠暴露于磷光成像屏1小時(shí)，并通過磷光成像系統(tǒng)（Amersham Biosciences）記錄凝膠的放射性信號(hào)。


ChIP。染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）方案遵循先前的研究。簡(jiǎn)而言之，將嗜麥芽窄食單胞菌在NYG培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD???為0.4。用1%甲醛交聯(lián)細(xì)胞，隨后用0.5 M甘氨酸淬滅5分鐘。通過離心收獲的細(xì)菌培養(yǎng)物（4毫升）用10毫升冰冷的Tris緩沖鹽水（TBS）緩沖液（20 mM Tris-HCl[pH 7.5],150 mM NaCl）洗滌兩次，然后重懸于1毫升裂解緩沖液（10 mM Tris[pH 8.0],20%蔗糖,50 mM NaCl,10 mM EDTA,10毫克/毫升溶菌酶）中。將IP緩沖液（50 mM HEPES-KOH[pH 7.5],150 mM NaCl,1 mM EDTA,1%Triton X-100,0.1%脫氧膽酸鈉,0.1%SDS,1 mM苯甲基磺酰氟）加入細(xì)菌細(xì)胞懸液中，并使用Diagenode Bioruptor UCD-300超聲破碎儀（Diagenode,USA）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行超聲處理，以產(chǎn)生平均約200 bp的DNA片段。離心后，用20微升蛋白A在4°C在慢速旋轉(zhuǎn)器上預(yù)清除溶液10分鐘，并保留100微升等分作為加樣對(duì)照DNA（輸入樣品）。對(duì)于ChIP測(cè)定，將20微升蛋白A-瓊脂糖珠（50%漿液）和2微升抗-His?抗體加入800微升等分中，并在4°C與慢速旋轉(zhuǎn)孵育過夜。第二天，通過離心收集珠子，并用IP緩沖液和洗滌緩沖液（10 mM Tris-HCl[pH 8.0],250 mM LiCl,1 mM EDTA,0.5%Nonidet P-40[相當(dāng)于Triton X-114],0.5%脫氧膽酸鈉）洗滌。通過加入100微升洗脫緩沖液（50 mM Tris[pH 7.5],10 mM EDTA,1%SDS）從珠子上洗脫免疫沉淀的染色質(zhì)，并將溶液在65°C孵育10分鐘。加入RNase A以去除RNA污染。使用蛋白酶K進(jìn)行交聯(lián)反轉(zhuǎn)。使用PCR純化試劑盒（Qiagen,USA）純化DNA。對(duì)于半定量PCR，使用1微升洗脫的DNA和1微升對(duì)照DNA作為模板，用適當(dāng)?shù)囊镞M(jìn)行PCR。捕獲的DNA量歸一化到對(duì)照輸入DNA。


EMSA。對(duì)于電泳遷移率變動(dòng)分析（EMSA），使用表2中所示的引物通過PCR擴(kuò)增bfmA和acoT操縱子的啟動(dòng)子區(qū)域。使用T4多核苷酸激酶（New England Biolabs[NEB],USA）用[γ-32P]ATP對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端標(biāo)記。將BfmA蛋白（1微克）和探針（4飛摩爾）在反應(yīng)緩沖液[10 mM Tris(pH 7.0),50 mM KCl,1 mM DTT(pH 7.5),2.5%甘油,5微升MgCl?,50納克/微升poly(dI-dC),0.05%NP-40,和10 mM EDTA]中孵育20分鐘。加入DNA上樣緩沖液（0.25%溴酚藍(lán),40%蔗糖）終止反應(yīng)，樣品通過8%非變性PAGE分離。使用磷光成像屏檢測(cè)放射性信號(hào)。不同濃度的未標(biāo)記DNA探針用作競(jìng)爭(zhēng)者。


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