摘要
本研究開發(fā)了一個(gè)模型，用于預(yù)測產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（VTEC）在發(fā)酵生肉香腸（FRMS）整個(gè)加工和儲(chǔ)存過程中的種群密度。通過收集公開資源中的概率和動(dòng)力學(xué)測量數(shù)據(jù)集，并在需要時(shí)補(bǔ)充新的測量數(shù)據(jù)，量化了VTEC生長和滅活對(duì)溫度、pH、水分活度（a_w）和乳酸濃度的依賴性。將預(yù)測結(jié)果與在中試工廠生產(chǎn)的VTEC污染FRMS中的觀察結(jié)果進(jìn)行了比較。根據(jù)發(fā)酵溫度（24°C或34°C）預(yù)測了VTEC減少的微小差異，在最高溫度下滅活程度更大。在高溫儲(chǔ)存期間觀察到最大的減少。在25°C下儲(chǔ)存66天后，觀察到種群數(shù)量減少超過6個(gè)十進(jìn)制對(duì)數(shù)單位，而在12°C下僅檢測到約1個(gè)對(duì)數(shù)單位的減少。評(píng)估了我們的模型和其他建模方法在干制和半干制FRMS加工過程中的性能。預(yù)測在干燥期長的干制FRMS中VTEC滅活程度最大，而在干燥期短的半干制FMRS中減少最小。該模型已在一個(gè)名為E.coli SafeFerment（EcSF）的計(jì)算工具中實(shí)現(xiàn)，EcSF整合了生長、生長概率、熱滅活和非熱滅活模型，以預(yù)測在恒定或波動(dòng)的環(huán)境條件下FRMS制造和儲(chǔ)存過程中的VTEC濃度。
引言
產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（VTEC），包括血清型O157:H7，是引起人類嚴(yán)重食源性疾病的病原體。VTEC的一個(gè)亞群能夠引起出血性結(jié)腸炎（HC）和溶血性尿毒癥綜合征（HUS），構(gòu)成腸出血性大腸桿菌（EHEC）。其中，一系列血清群（即O157、O26、O103、O91、O145和O111）與公共衛(wèi)生問題非常頻繁地相關(guān)。
牛是VTEC的主要儲(chǔ)存宿主。傳播主要通過食用未煮熟的受感染牛肉、未經(jīng)巴氏消毒的乳制品、蔬菜或受污染的水發(fā)生。也有報(bào)道人際傳播。與食源性大腸桿菌O157:H7暴發(fā)相關(guān)的劑量估計(jì)在2到2,000個(gè)細(xì)菌之間。如此低的劑量意味著這種微生物不需要在產(chǎn)品中生長就能引起疾病。在美國，VTEC每年估計(jì)導(dǎo)致260,000例疾病，3,700例住院和20例死亡。在歐洲，估計(jì)每年病例數(shù)約為3,000至4,000例。
發(fā)酵生肉香腸（FRMS）是通過發(fā)酵、干燥、香料、鹽、亞硝酸鈉以及Starter培養(yǎng)物活性產(chǎn)生乳酸并降低培養(yǎng)基pH值的組合來抑制病原菌生長和/或存活的產(chǎn)物。已報(bào)道了幾起涉及被VTEC污染的FRMS的食源性暴發(fā)。在歐盟，碎肉和/或發(fā)酵肉及其制品因可能受VTEC污染而被視為對(duì)公共衛(wèi)生構(gòu)成危害。在美國，發(fā)酵香腸生產(chǎn)過程中要求大腸桿菌種群減少5個(gè)對(duì)數(shù)單位，而所需減少量為3個(gè)對(duì)數(shù)單位。
由VTEC引起的食源性暴發(fā)數(shù)量不斷增加，促使人們努力了解其在幾種環(huán)境條件下的種群動(dòng)態(tài)，包括生長和衰減速率以及生長限制。預(yù)測食品中大腸桿菌和其他細(xì)菌種群動(dòng)力學(xué)的模型可在幾個(gè)公共資源獲得，例如ComBase門戶網(wǎng)站、PMP或FoodRisk.org。大腸桿菌生長對(duì)環(huán)境的依賴性已在廣泛的食品條件下建模。在肉湯和包括FMRS在內(nèi)的食品中也估計(jì)了大腸桿菌的生長/無生長邊界和滅活。具體來說，大腸桿菌O157:H7的滅活已被建模為由于Starter培養(yǎng)物和酵母在橄欖發(fā)酵過程中的代謝活動(dòng)導(dǎo)致的培養(yǎng)基變化函數(shù)，以及作為pH和水分活度（a_w）在soudjouk式發(fā)酵香腸發(fā)酵和干燥過程中的函數(shù)。公開可用的軟件THERM根據(jù)生肉產(chǎn)品的時(shí)間-溫度歷史預(yù)測大腸桿菌O157:H7和其他病原體的生長或不生長；更具體地說，澳大利亞食品安全卓越中心提供了實(shí)現(xiàn)預(yù)測生肉中和發(fā)酵肉制品中大腸桿菌O157:H7滅活的工具。然而，預(yù)測VTEC在涵蓋FRMS制造和儲(chǔ)存特有的生長和無生長環(huán)境范圍內(nèi)的響應(yīng)尚未得到解決。
這項(xiàng)工作的目的是量化VTEC在FRMS制造和儲(chǔ)存條件下的響應(yīng)，并開發(fā)一個(gè)用戶友好的動(dòng)態(tài)建模框架來預(yù)測這些過程中VTEC生物的濃度。我們?cè)谖墨I(xiàn)和公開數(shù)據(jù)源中進(jìn)行了廣泛搜索，涉及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基和食品中不同溫度、pH、a_w和乳酸條件下的生長和滅活速率以及生長/無生長限制。此外，還實(shí)驗(yàn)生成了新數(shù)據(jù)以解決數(shù)據(jù)空白，并在中試工廠制造了FRMS，以評(píng)估模型對(duì)制造和儲(chǔ)存過程中VTEC種群密度的預(yù)測。
為了促進(jìn)模型的應(yīng)用，它已被實(shí)現(xiàn)為一個(gè)名為E.coli SafeFerment（EcSF）的Excel加載項(xiàng)。EcSF工具結(jié)合了生長、生長概率和滅活模型，以預(yù)測在恒定或波動(dòng)的環(huán)境條件下FRMS生產(chǎn)和儲(chǔ)存任何階段的VTEC濃度。
材料與方法
數(shù)據(jù)收集
用于開發(fā)VTEC模型的數(shù)據(jù)集來自ComBase數(shù)據(jù)庫或文獻(xiàn)，或由塔斯馬尼亞大學(xué)食品安全中心友好提供。本工作還生成了額外數(shù)據(jù)以解決數(shù)據(jù)空白（見補(bǔ)充材料中的表S1）。補(bǔ)充材料中的表S2顯示了公開數(shù)據(jù)和新生成數(shù)據(jù)中使用的血清型和菌株。
數(shù)據(jù)生成
(i)菌株、接種物和培養(yǎng)基制備
本工作使用兩種產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌菌株來測量非熱滅活速率，并在各種溫度、pH、a_w組合以及幾種乳酸濃度下生成生長/無生長觀察結(jié)果。這些是2006年挪威由含有羊肉牛肉（morr）的發(fā)酵香腸引起的暴發(fā)中涉及的O103:H25菌株，以及2002年瑞典由冷熏發(fā)酵香腸引起的暴發(fā)中涉及的O157:H7 218菌株。
使用先前構(gòu)建并評(píng)估了在各種環(huán)境條件下實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基中生長和滅活的利福平抗性（Rif'）菌株大腸桿菌O157:H7 218Rif和O103:H25 Rif'來接種FRMS。在胰蛋白酶大豆肉湯（TSB;Oxoid,United Kingdom）和pH 5.5含10,000 ppm乳酸的TSB中評(píng)估了野生型和Rif突變菌株的生長；在pH 4.0、a_w值等于0.90含45,000 ppm乳酸的TSB中測量了滅活。在所有測試條件下，Rif菌株的生長和滅活響應(yīng)與野生型菌株相同（數(shù)據(jù)未顯示）。
菌株培養(yǎng)物在-70°C下用20%甘油保存。實(shí)驗(yàn)前，將野生型菌株的接種物在37°C的TSB中連續(xù)三次傳代培養(yǎng)24小時(shí)。Rif菌株接種物按先前描述制備。需要時(shí)，用6 N NaOH和1 N HCl無菌調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH，并在高壓滅菌前向培養(yǎng)基中加入乳酸（90.08 g/liter;90%acid）和NaCl。水分活度基于TSB中補(bǔ)充NaCl（已含0.5%），并根據(jù)方程a_{w}=-0.0071times percent NaCl+1.0054text{估計(jì)，如先前報(bào)道}。
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