2結(jié)果與分析
2.1酒曲中產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌株的確定
2.1.1菌株初篩
利用倍比稀釋法從發(fā)酵的江米酒中分離純化得到13株不同菌落形態(tài)的純種菌株，將分離純化得到的13株不同菌株分別以三點(diǎn)法點(diǎn)接于酪蛋白平板上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 d，觀察并測(cè)定菌株所產(chǎn)凝乳圈及水解圈直徑（表1）。
表1不同菌株在酪蛋白平板上凝乳圈和水解圈直徑
從表1可以看出，LB-41D、PDA-41、PDA-61、PDA-82和yD-42這5株菌所產(chǎn)凝乳圈和水解圈直徑為0，表明這5株菌不產(chǎn)生凝乳酶。其余8株菌在酪蛋白平板上都有不同大小的凝乳圈和水解圈。白色凝乳圈大說明菌株產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力高，水解圈大說明菌株產(chǎn)凝乳酶蛋白水解活力高。菌株所產(chǎn)凝乳酶蛋白水解活力的大小對(duì)干酪質(zhì)構(gòu)和特殊風(fēng)味有著重要的影響，蛋白水解活力高使干酪中蛋白水解過度生成苦味肽而導(dǎo)致制作的干酪有苦味，使消費(fèi)者難以接受。所以在篩選過程中應(yīng)選取凝乳活力高而蛋白水解活力低的菌株。從有不同大小凝乳圈和水解圈的8株不同菌株來看，其中LB-51菌株所產(chǎn)凝乳圈直徑最大同時(shí)水解圈直徑較小，由此可以初步選擇LB-51菌株為產(chǎn)凝乳酶優(yōu)勢(shì)菌。
2.1.2菌株的復(fù)篩
將有白色凝乳圈的8株菌分別接種于LB、yPD和PDA液體培養(yǎng)基中，在30℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，測(cè)定凝乳和蛋白水解活力，結(jié)果如表2所示。
表2菌株在不同培養(yǎng)基中產(chǎn)酶活力
由表2可知，菌株在LB中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力相對(duì)較高，在液體PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力最低。其中LB-51菌株在LB中發(fā)酵24 h時(shí)產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力可達(dá)320 SU/mL，在8株菌中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力最高，同時(shí)LB-51菌株在LB中發(fā)酵時(shí)蛋白水解活力相對(duì)較低。所以確定LB-51菌株是酒曲中產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)勢(shì)菌。對(duì)于8株菌株選擇了3種不同的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，只有在LB中產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力較為理想；部分菌株在yPD和PDA中產(chǎn)酶活力不高或不產(chǎn)凝乳酶，這與培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)成分和比例有關(guān)，說明這2種培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分和比例不適合菌株產(chǎn)凝乳酶。所以3種液體培養(yǎng)基中選擇LB作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，可通過優(yōu)化其營(yíng)養(yǎng)成分和比例來進(jìn)一步提高菌株的產(chǎn)凝乳酶的凝乳活力。
2.2菌株初步鑒定
2.2.1形態(tài)學(xué)觀察
圖1 LB-51菌株菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色照片（B）
將菌株LB-51在LB固體平板上劃線培養(yǎng)48 h后，其菌落為乳白色稍顯微黃，菌落邊緣不整齊，表面粗糙有黏液，不透明。通過革蘭氏染色、芽孢染色和穿刺培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，菌株LB-51為革蘭氏反應(yīng)為陽(yáng)性，短桿狀，具有運(yùn)動(dòng)性，有芽孢，芽孢中生。
2.2.2 API生化試劑條法
將API生化試劑條法對(duì)菌株LB-51的發(fā)酵結(jié)果（表3）提交ApiWeb軟件中進(jìn)行比對(duì)鑒定，結(jié)果可初步判定菌株LB-51為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）或地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）。
表3 LB-51菌株的主要生理學(xué)特性
2.2.3菌株16S rDNA序列擴(kuò)增結(jié)果
圖2菌株LB-51的16S rDNA瓊脂糖凝膠電泳圖
以菌株LB-51基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果在約1 500 bp處有一條特異性條帶，結(jié)果見圖2。將PCR產(chǎn)物回收純化后進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果菌株LB-51的16S rDNA序列長(zhǎng)度為1 450 bp。
2.2.4基于16S rDNA序列同源性比對(duì)與系統(tǒng)發(fā)育分析
圖3以16S rDNA序列為基礎(chǔ)的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1菌株系統(tǒng)發(fā)育樹
將菌株LB-51的16S rDNA基因序列與在GenBank中序列大小相近的已知菌株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，然后選取與LB-51序列同源性較高的菌株序列，利用MEGA6.0軟件進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。結(jié)果如圖3所示，菌株LB-51與解淀粉芽孢桿菌MPA1034（HQ231913.1）在同一分支上，并通過MEGA 6.0軟件中Bootstrap的驗(yàn)證表明它們具有較高的置信度，且支持率可達(dá)100%。結(jié)合上述形態(tài)學(xué)、生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果可將菌株LB-51確定為解淀粉芽孢桿菌，并進(jìn)一步將此產(chǎn)凝乳酶菌株命名為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1。
相關(guān)新聞推薦
1、生長(zhǎng)曲線分析儀研究食竇魏斯氏菌生物學(xué)共性及抑菌譜特性（二）
2、原生動(dòng)物而非噬菌體主導(dǎo)對(duì)細(xì)菌的長(zhǎng)期下行調(diào)控（三）
3、基于矩陣種群模型量化溫度對(duì)原綠球藻（?海洋中最微小的生物之一）的非線性影響