圖3 、白色念珠菌EVs對(duì)糞腸球菌生物膜具有雙重作用。(a)用不同濃度的EV處理后糞腸球菌生物膜形成的掃描電鏡照片。(b)用不同濃度的EV處理后，糞腸球菌生物膜在細(xì)胞攀爬片上染色的代表性CLSM圖像(比例尺=50μm)。(c)用不同濃度的EV處理的糞腸球菌生物膜的CFU。(d)基于共聚焦圖像的糞腸球菌生物量定量。(e)用不同濃度的EV處理的糞腸球菌生物膜的結(jié)晶紫染色。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
圖4、 白色念珠菌EVs對(duì)糞腸球菌對(duì)有害環(huán)境的抵抗力具有雙重作用。(a)糞腸球菌生物膜對(duì)3%NaOCl的存活率。(b)在饑餓堿性環(huán)境下培養(yǎng)的糞腸球菌生物膜的存活率。在pH9.0和11.0的PBS中的存活率由對(duì)照組(pH7.4)的細(xì)胞數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p<0.05，***p<0.001，ns，無(wú)顯著性。
圖5 、不同濃度的白色念珠菌EVs對(duì)糞腸球菌感染牙本質(zhì)和在杜仲膠上形成生物膜的影響相反。(a)用不同濃度的EV處理后，根管壁和牙本質(zhì)小管內(nèi)糞腸球菌的掃描電鏡照片。(b)用不同濃度的EV處理后，糞腸球菌生物膜在杜仲膠頂面染色的代表性圖像(比例尺=50μm)。紅色框顯示了生物膜的部分放大視圖(比例尺=20μm)。(c)基于共聚焦圖像的糞腸球菌生物量定量。(d)與不同濃度EV共培養(yǎng)的杜仲膠上糞腸球菌生物膜的CFU。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
總結(jié)
研究表明糞腸球菌與白色念珠菌在治療后牙髓病中存在重要關(guān)系。然而，對(duì)于真菌-細(xì)菌相互作用及其可能的功能途徑了解較少。在本研究中，相關(guān)科研人員研究了源自白色念珠菌的細(xì)胞外囊泡對(duì)糞腸球菌生長(zhǎng)和致病性的影響。從酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分離白色念珠菌EVs，觀察并鑒定其形態(tài)、尺寸分布和蛋白濃度。使用生長(zhǎng)曲線和菌落形成單位計(jì)數(shù)評(píng)估EVs對(duì)浮游態(tài)糞腸球菌的影響，而使用掃描電子顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡確定EVs對(duì)糞腸球菌生物膜的影響。檢測(cè)了糞腸球菌抵抗不利環(huán)境、感染牙本質(zhì)小管以及在牙膠尖上形成生物膜的能力。此外評(píng)估了EVs對(duì)糞腸球菌細(xì)胞侵襲和細(xì)胞毒性的影響。
使用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p值<0.05被認(rèn)為具有顯著差異。白色念珠菌EVs是具有雙層膜的納米顆粒，峰值尺寸為111.9和230 nm。EVs對(duì)糞腸球菌及其生物膜表現(xiàn)出復(fù)雜的影響；5μg/mL的EVs顯示出抑制作用，而0.156μg/mL的EVs促進(jìn)其生長(zhǎng)。EVs對(duì)糞腸球菌毒力表現(xiàn)出持續(xù)的影響。值得注意的是，5μg/mL的EVs減少了糞腸球菌對(duì)RAW264.7細(xì)胞造成的損傷，以及糞腸球菌對(duì)巨噬細(xì)胞的侵襲能力和巨噬細(xì)胞吞噬后糞腸球菌的胞內(nèi)存活能力，而0.156μg/mL的EVs則具有完全相反的效果。白色念珠菌EVs對(duì)糞腸球菌的生長(zhǎng)和毒力具有雙重影響，高濃度EVs抑制糞腸球菌的生長(zhǎng)和毒力，而低濃度EVs則促進(jìn)其生長(zhǎng)和毒力。
這表明白色念珠菌EVs參與了真菌-細(xì)菌間的通信，可能為控制糞腸球菌提供新的策略。本研究首次系統(tǒng)揭示了白色念珠菌EVs在調(diào)控糞腸球菌致病性中的雙重作用，為理解真菌-細(xì)菌跨界互作提供了新的分子機(jī)制。高濃度EVs（5μg/mL）展現(xiàn)出的抑制作用提示其可能作為控制糞腸球菌感染的新型制劑，為PTED的防治提供了潛在策略。未來(lái)研究將進(jìn)一步解析EVs中活性成分及其作用機(jī)制，為臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。Bioscreen全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀在本研究中的應(yīng)用體現(xiàn)了其在高通量、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)、自動(dòng)化操作等方面的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)的手工測(cè)定方法相比，該設(shè)備能夠提供更連續(xù)、更精確的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)，為微生物相互作用研究提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。本研究通過(guò)該設(shè)備獲得的可靠數(shù)據(jù)，為理解白色念珠菌與糞腸球菌之間的跨界通訊機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
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