豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種腸道傳染性疾病，該病毒可感染所有年齡段的豬，但7日齡以內(nèi)的仔豬最易感，主要引起仔豬急性腹瀉、嘔吐、脫水甚至死亡，發(fā)病率和死亡率可高達100%。自2010年以來，PEDV變異毒株引起的仔豬腹瀉呈現(xiàn)新的流行特征，即使免疫過PED疫苗的豬場也未能幸免，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，因此，當務(wù)之急是采取有力的措施加強對PED的防控。
目前PED的防控除了加強飼養(yǎng)管理外，主要以疫苗預防為主，但由于病毒的高變異性，現(xiàn)有疫苗已不能提供足夠的保護力，因此，開發(fā)可抑制PEDV感染的藥物迫在眉睫。PEDV與經(jīng)典冠狀病毒生命周期一致，該病毒的S蛋白與宿主細胞表面的受體結(jié)合并吸附，從而啟動病毒粒子的生命周期。PEDV基因組與細胞核糖體結(jié)合后翻譯非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structural protein 1-16，nsp1-16)和逆轉(zhuǎn)錄復合物(reverse transcription complex，RTC)，不連續(xù)的基因組可翻譯結(jié)構(gòu)蛋白:纖突蛋白(spike protein，S蛋白)、膜蛋白(membrane protein，M蛋白)、包膜蛋白(envelope protein，E蛋白)、核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N蛋白)和輔助蛋白(ORF3蛋白)。與N蛋白結(jié)合的病毒基因組在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間區(qū)室(ERGIC)進行組裝并進入含有病毒結(jié)構(gòu)蛋白(S、E和M蛋白)的ERGIC膜，導致成熟病毒體的形成，完成病毒粒子的復制過程，最后病毒粒子經(jīng)細胞膜以胞吐的方式釋放到細胞外，又可開始新一輪的感染。盡管目前國內(nèi)外科研者針對PEDV生命周期的不同階段已發(fā)現(xiàn)多種能夠抑制PEDV活性的抗病毒藥物，但多數(shù)正處于實驗室的研究階段，尚未獲得批準。
鹽霉素(salinomycin，SLM)又名沙利霉素，是1968年首次由日本科研株式會社發(fā)現(xiàn)的一元羧酸聚醚類廣譜抗生素，其對癌癥、球蟲原蟲、革蘭陽性細菌和耐藥菌株都具有抑制活性。SLM作用之多的原因可能是因為其可以參與多種信號通路的調(diào)節(jié)，例如，抑制Wnt/β-catenin信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，啟動細胞的自噬，降低三磷酸腺苷(ATP)的水平，促進活性氧(ROS)的產(chǎn)生，觸發(fā)DNA損傷和預防DNA修復，抑制核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)信號通路。以上信號通路與病毒感染靶細胞后的增殖密切相關(guān)，說明SLM可能是一種抗病毒候選藥物，然而SLM對PEDV的抑制效果尚不清楚。
本研究旨在探索SLM體外對PEDV的抑制效果及其對病毒復制周期的影響，為SLM作為一種新的抗PEDV藥物的開發(fā)提供理論支持，并為后期SLM抑制PEDV感染機制的研究奠定基礎(chǔ)。
1材料與方法
1.1細胞、病毒和主要試劑
非洲綠猴腎細胞(Vero)、PEDV CV777毒株均由本實驗室保存。MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司;胎牛血清(FBS)、胰酶(TRYPSIN/EDTA)購自Multicell公司;PEDV N蛋白單克隆抗體由本實驗室制備并保存;小鼠抗GAPDH單克隆抗體、ECL化學發(fā)光超敏顯色試劑盒購自翌圣公司;HRP-山羊抗小鼠IgG(H+L)購自博奧龍公司;CCK-8試劑盒購自Biosharp公司;2×AugeGreen Master Mix購自UE公司;鹽霉素購自MCE公司。
1.2病毒滴度的測定
將Vero細胞接種于Bioscreen全自動生長曲線分析儀的96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃5%CO2細胞培養(yǎng)箱中，待細胞長到90%后，每孔接種100μL倍比稀釋(10-2～10-7)的PEDV病毒液，接毒后72 h統(tǒng)計細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)。用Reed-Muench兩式法計算病毒滴度(TCID50)。
1.3病毒生長曲線的測定
將Vero細胞接種于細胞培養(yǎng)皿，待細胞長到90%，將細胞上清液換為維持液培養(yǎng)12 h，吸出細胞上清液，用0.01 mol·L-1pH 7.2～7.4的PBS洗滌細胞，然后感染0.5 MOI PEDV，對照組加入等量維持液，37℃孵育2 h后更換新維持液繼續(xù)培養(yǎng)，最后收集感染后1、12、24、48、60 h的病毒液，測定病毒吸光度（OD600）。
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