研究簡介
梭菌（Clostridia）是一類革蘭氏陽性厭氧細(xì)菌，在醫(yī)學(xué)、工業(yè)及環(huán)境領(lǐng)域具有重要價值，但其遺傳操作工具匱乏，限制了對其基因組功能的研究和生物技術(shù)應(yīng)用。本研究以模式梭菌Clostridium phytofermentans為對象，開發(fā)了一種結(jié)合靶向內(nèi)含子（targetron）和Cre重組酶的基因組工程系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了大規(guī)模、無標(biāo)記的基因組刪除與插入，為梭菌的基因功能研究和代謝工程提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。研究人員設(shè)計(jì)了一套質(zhì)粒系統(tǒng)，通過靶向內(nèi)含子將特定的lox位點(diǎn)（如lox71、lox66）精確插入基因組目標(biāo)位置。隨后，利用Cre重組酶介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組，實(shí)現(xiàn)大片段DNA的刪除或外源基因的插入。通過靶向內(nèi)含子將lox71和lox66位點(diǎn)分別插入原噬菌體區(qū)域兩端，Cre重組后成功刪除39 kb的50個基因原噬菌體島，并通過PCR和測序驗(yàn)證刪除效率達(dá)100%。采用重組介導(dǎo)的盒式交換（RMCE）策略，將帶有異源spacer的lox511/71和loxFAS/66串聯(lián)cassette插入基因組中性位點(diǎn)（如cphy1575），再通過Cre重組將誘導(dǎo)型熒光報告基因（P3368-FbFP）整合到基因組中，實(shí)現(xiàn)碳源依賴性表達(dá)。研究人員還通過重組介導(dǎo)的盒式交換（RMCE）在基因組中中性位點(diǎn)插入了一個可誘導(dǎo)的熒光報告基因，該方法利用基因組和質(zhì)粒上的串聯(lián)lox位點(diǎn)以及特異性間隔，防止盒式內(nèi)重組。這些方法普遍為梭菌的無標(biāo)記基因組工程提供了便利，有助于研究其基因組結(jié)構(gòu)和調(diào)控機(jī)制。
Bioscreen全自動生長曲線分析儀的應(yīng)用
Bioscreen C全自動生長曲線分析儀用于精確、高效地監(jiān)測不同遺傳修飾菌株在不同碳源上的生長表現(xiàn)。評估原噬菌體刪除對菌株代謝適應(yīng)性影響時，全自動生長曲線分析儀用于比較野生型（WT）、雙插入菌株（DI-SS）和原噬菌體刪除菌株（Del-SS）在四種碳源（葡萄糖、纖維二糖、木糖、半乳糖）上的生長曲線。在100孔微孔板中同時培養(yǎng)多組菌株（每組4個重復(fù)），確保數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)可靠性，板孔在厭氧艙（2%H?,98%N?）中密封，模擬梭菌的嚴(yán)格厭氧生長條件。每孔在600 nm波長下自動測定光密度（OD???），并通過周期性震蕩（每次讀數(shù)前震蕩30秒）保證菌液均勻性。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
本研究成功開發(fā)并驗(yàn)證了一種基于靶向內(nèi)含子（targetron）與Cre重組酶的基因組工程系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在模式梭菌Clostridium phytofermentans中進(jìn)行大規(guī)模、精準(zhǔn)且無標(biāo)記的基因組刪除與插入。通過靶向內(nèi)含子將優(yōu)化的lox71和lox66位點(diǎn)精準(zhǔn)插入基因組原噬菌體區(qū)域（cphy2944-cphy2993）兩側(cè)，Cre重組酶介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組成功刪除了39 kb的50個基因片段。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)兩個lox位點(diǎn)方向一致時，重組后穩(wěn)定保留lox72位點(diǎn)；若方向相反，則因反向重復(fù)序列的不穩(wěn)定性導(dǎo)致大部分片段丟失，僅殘留短疤痕。這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)基因組編輯中位點(diǎn)方向設(shè)計(jì)提供了重要參考。刪除原噬菌體區(qū)域后，突變株在葡萄糖上的生長與野生型無差異，但在纖維二糖、木糖等非偏好碳源上生長顯著受限，表明原噬菌體基因可能通過調(diào)控代謝適應(yīng)性參與宿主應(yīng)激響應(yīng)。RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)一步揭示，原噬菌體中的cphy2976基因在非葡萄糖碳源中表達(dá)上調(diào)數(shù)十倍，提示其可能作為關(guān)鍵因子影響宿主代謝網(wǎng)絡(luò)。通過重組介導(dǎo)的盒式交換（RMCE），將攜帶異源spacer的lox511/71-loxFAS/66cassette整合至中性基因組位點(diǎn)（cphy1575），并進(jìn)一步利用Cre重組酶將誘導(dǎo)型熒光報告基因（P3368-FbFP）精準(zhǔn)插入。該熒光蛋白在纖維二糖誘導(dǎo)下表達(dá)顯著增強(qiáng)，證明了其作為碳源響應(yīng)型報告工具的可行性。靶向內(nèi)含子-Cre重組酶系統(tǒng)填補(bǔ)了梭菌基因組編輯技術(shù)的空白，通過精準(zhǔn)操控大片段DNA，為理解梭菌生物學(xué)特性及開發(fā)其工業(yè)應(yīng)用奠定了方法論基礎(chǔ)。
圖1、C.phytofermentans基因組缺失與插入概覽.(A)pQlox71引入，通過targetron編碼的LtrA蛋白在基因組中插入lox71（L71）位點(diǎn)。(B)pQlox71清除后，引入pQlox66，在基因組中插入lox66（L66）位點(diǎn)。(C)pQlox66清除后，引入pQcre1，Cre介導(dǎo)重組刪除lox66與lox71位點(diǎn)間的序列。(D)通過PCR確認(rèn)缺失和lox72位點(diǎn)（箭頭表示引物位置）。(E)引入pQadd1，將lox511/71（L5-71）和loxFAS/66（LF-66）盒送入基因組。(F)pQadd1清除后，引入pQadd2，攜帶目標(biāo)插入序列，位于lox511/66（L5-66）和loxFAS/71（LF-71）位點(diǎn)之間。(G)引入pQcre2，實(shí)現(xiàn)Cre介導(dǎo)的RMCE。(H)得到的株基因組中插入序列被lox511/72（L5-72）和loxFAS/72（LF-72）夾持，通過PCR確認(rèn)（箭頭表示引物）。
圖2、在C.phytofermentans中構(gòu)建targetron插入lox71（cphy2944）與lox66（cphy2993）株。(A)基因組區(qū)域及l(fā)ox盒targetron插入位點(diǎn)。顯示B與E面板使用的引物位置。(B)對3個DI-AS分離株（DI1-DI3）通過PCR確認(rèn)lox71插入cphy2944（引物2944_1/2）與lox66插入cphy2993（引物2993_1/2）。(C-D)DI1的DNA測序色譜圖：cphy2944中l(wèi)ox71位點(diǎn)（C），cphy2993中l(wèi)ox66位點(diǎn)（D），紅色顯示臂突變，8-bp中央間隔標(biāo)出。(E)逆向PCR（引物int_1/2）顯示3個DI-AS分離株僅含預(yù)期的2個基因組targetron插入。3.5 kb條帶對應(yīng)cphy2944插入，1.3 kb條帶對應(yīng)cphy2993插入。
圖3、Cre介導(dǎo)的基因組缺失。(A)PCR檢測cphy2944（引物2944_1/2）、cphy2993（引物2993_1/2）及38.9 kb區(qū)域（引物2944_1/2993_2），比較pQcre1轉(zhuǎn)化前（DI-SS、DI-AS）與轉(zhuǎn)化后（Del-SS、Del-AS）。(B-C)Del-AS中內(nèi)含子片段（B）和Del-SS中l(wèi)ox72位點(diǎn)（C）的DNA測序色譜圖，紅色標(biāo)出回文位置或中央間隔。(D-E)Cre介導(dǎo)lox71與lox66之間基因組缺失模型：Del-AS株為雙向內(nèi)含子重組成28-bp內(nèi)含子片段（無lox72），Del-SS株為單向內(nèi)含子（含lox72）。
圖4、C.phytofermentans WT、DI-SS與Del-SS的生長曲線。在葡萄糖（A）、纖維二糖（B）、木糖（C）、半乳聚糖（D）上測量。數(shù)據(jù)點(diǎn)為4個培養(yǎng)物均值，陰影區(qū)為標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。(E-H)RNA-seq測量WT在不同碳源條件下cphy2944-cphy2993的mRNA表達(dá)（log2(RPKM)±SD，重復(fù)培養(yǎng)物）；星號表示相對于葡萄糖的差異表達(dá)基因。
圖5、C.phytofermentans中RMCE基因組插入。(A)int1575株cphy1575區(qū)域示意圖，包括PCR引物位置（1575_1/2）及targetron數(shù)目（int_1/2）。(B)PCR顯示W(wǎng)T與int1575株（引物1575_1/2）中targetron含lox511/71-loxFAS/66盒的插入。(C)int1575基因組逆向PCR（引物int_1/2）顯示僅有單個targetron插入，5.1 kb條帶對應(yīng)預(yù)期cphy1575插入。(D)pQadd2與pQcre2可在int1575株中共存，通過PCR檢測質(zhì)粒復(fù)制子來源，比較轉(zhuǎn)移前后狀態(tài)。(E)int1575_FbFP株中cphy1575區(qū)域示意圖，顯示RMCE插入P3368-FbFP盒。(F)PCR顯示P3368-FbFP盒成功插入int1575_FbFP。(G)熒光測定（激發(fā)448/20 nm，發(fā)射495/20 nm）顯示W(wǎng)T與int1575_FbFP株纖維二糖誘導(dǎo)表達(dá)FbFP，條形圖為三重復(fù)培養(yǎng)的平均熒光值標(biāo)準(zhǔn)化OD600±SD。
總結(jié)
本研究成功開發(fā)并驗(yàn)證了一種基于靶向內(nèi)含子（targetron）與Cre重組酶的基因組工程系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了在模式梭菌Clostridium phytofermentans中進(jìn)行大規(guī)模、精準(zhǔn)且無標(biāo)記的基因組刪除與插入。設(shè)計(jì)了一套質(zhì)粒系統(tǒng)，通過靶向內(nèi)含子將特定的lox位點(diǎn)（如lox71、lox66）精確插入基因組目標(biāo)位置。隨后，利用Cre重組酶介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組，實(shí)現(xiàn)大片段DNA的刪除或外源基因的插入。通過靶向內(nèi)含子將lox71和lox66位點(diǎn)分別插入原噬菌體區(qū)域兩端，Cre重組后成功刪除39 kb的50個基因原噬菌體島，并通過PCR和測序驗(yàn)證刪除效率達(dá)100%。
采用重組介導(dǎo)的盒式交換（RMCE）策略，將帶有異源spacer的lox511/71和loxFAS/66串聯(lián)cassette插入基因組中性位點(diǎn)（如cphy1575），再通過Cre重組將誘導(dǎo)型熒光報告基因（P3368-FbFP）整合到基因組中，實(shí)現(xiàn)碳源依賴性表達(dá)。本研究不僅為梭菌基因組功能解析提供了關(guān)鍵工具，還通過原噬菌體刪除和報告基因插入案例，展示了其在代謝工程（如生物燃料生產(chǎn)）和環(huán)境適應(yīng)性研究中的潛力。該系統(tǒng)的通用性設(shè)計(jì)暗示其可擴(kuò)展至其他難操作的厭氧細(xì)菌，推動微生物資源的開發(fā)與利用。靶向內(nèi)含子-Cre重組酶系統(tǒng)填補(bǔ)了梭菌基因組編輯技術(shù)的空白，通過精準(zhǔn)操控大片段DNA，為理解梭菌生物學(xué)特性及開發(fā)其工業(yè)應(yīng)用奠定了方法論基礎(chǔ)。
Bioscreen C提供的生長動力學(xué)數(shù)據(jù)是連接基因操作（原噬菌體刪除）與表型變化的直接證據(jù)，彌補(bǔ)了分子生物學(xué)工具（如PCR、測序）無法反映功能缺陷的局限，通過高通量、可控的厭氧培養(yǎng)與動態(tài)監(jiān)測，揭示了原噬菌體刪除對碳源代謝的負(fù)面影響，凸顯了其在微生物遺傳學(xué)研究中對精細(xì)表型解析的價值。
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