纖維素物質(zhì)是地球上含量最豐富的碳水化合物，而目前人類對(duì)纖維素的開發(fā)與利用還非常有限，因此如何更有效地開發(fā)和利用纖維素資源已成為當(dāng)今世界的熱門課題之一。目前，對(duì)纖維素的降解利用主要是用酸堿處理等化學(xué)手段，以及汽爆及蒸汽加熱等物理手段。生物法由于對(duì)設(shè)備要求低，分解后的產(chǎn)物易回收利用，以及對(duì)環(huán)境污染較小等特點(diǎn)而備受重視。纖維素是一個(gè)復(fù)雜酶系，根據(jù)其功能的不同可分為3類：作用于纖維素非結(jié)晶區(qū)的內(nèi)切葡聚糖酶（CMC）；作用于無定型區(qū)切割糖苷鍵的外切葡聚糖酶（FP）；以及作用于纖維二糖的β-葡萄糖苷酶（BG）。協(xié)同作用才能將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的天然纖維降解。纖維素酶在食品、洗滌、紡織、飼料、造紙等方面具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景。通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的67株菌株進(jìn)行初篩和復(fù)篩，A25這一株菌株是本次實(shí)驗(yàn)所篩選的，具有較高降解纖維素活力的菌株，本文對(duì)其纖維素酶的生產(chǎn)培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，對(duì)于了解其降解機(jī)制以及實(shí)際應(yīng)用都有重要意義。
DNS法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
稱0.05g經(jīng)105℃烘干至恒重的葡萄糖溶于少量蒸餾水中，用蒸餾水定溶至500mL配制成濃度為50μg/mL的葡萄糖溶液。取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL和1.2mL葡萄糖溶液再加入蒸餾水將體積配制至10mL。再分別從中取2mL，再加蒸餾水1.0mL再加DNS試劑2.0mL搖勻，置于沸水中煮沸5min，取出置與冷水中冷卻到室溫，測其OD530值。根據(jù)OD值，以葡萄糖濃度為縱坐標(biāo)，吸光值為橫坐標(biāo)，列出直線回歸方程（Y=aX+b）。
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
參照1.2.1所描述的方法制備出標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線（圖1），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖曲線求出直線回歸方程y=0.003 4x-0.505，R2=0.996 8（y：葡萄糖濃度，x：OD530的值），通過直線回歸方程可以計(jì)算纖維素酶酶促反應(yīng)中產(chǎn)生葡萄糖的濃度，從而根據(jù)酶活力單位定義算出酶活。
高產(chǎn)纖維素酶菌株的初篩
纖維素在纖維素酶的作用下水解成纖維二糖和葡萄糖，水解后的糖類與剛果紅染料形成紅色沉淀，使產(chǎn)酶菌株的菌落周圍出現(xiàn)清晰的紅色水解圈，根據(jù)水解圈的大小可粗略的估計(jì)菌株產(chǎn)酶的情況，然后選取透明圈較大的菌株進(jìn)行接種。剛果紅是對(duì)纖維素酶進(jìn)行初步篩選的試驗(yàn)方法，實(shí)驗(yàn)方法比較簡單。通過它可以使纖維素固體培養(yǎng)基上的菌種的代謝產(chǎn)物形成淺紅色水解透明圈。用剛果紅染液覆蓋培養(yǎng)皿一層靜止染色30min，纖維素酶菌株產(chǎn)纖維素酶越多，產(chǎn)生的紅色水解透明圈越大，產(chǎn)纖維素酶速度越快，淺紅色水解透明圈出現(xiàn)的越早。雖然水解透明圈H/C的比值大小直接反映了酶活水平的高低，但不能完全代表菌株產(chǎn)酶能力，不能定量說明該菌株產(chǎn)纖維素酶的能力。也有研究表明液體樣品的酶濃度與透明圈的直徑（下轉(zhuǎn)127頁）（上接24頁）成線性關(guān)系，可以對(duì)酶活進(jìn)行初步定量。
高產(chǎn)纖維素酶菌株的復(fù)篩
已知纖維素酶的作用方式：CO酶是使天然纖維素晶體分鏈，起一個(gè)分離和水合作用，從而使天然纖維素裂解成為直鏈纖維素；而C0酶雖不能水解天然纖維素，但能水解直鏈纖維素的β-l，4-葡萄糖苷鍵生成纖維二糖，纖維二糖再經(jīng)β-葡萄糖苷酶水解成為葡萄糖。前人研究認(rèn)為，纖維素的降解關(guān)鍵是濾紙酶活的高低，再結(jié)合β-葡萄糖苷酶活，而CMC酶活只作參考。通過對(duì)7個(gè)菌株發(fā)酵液的濾紙酶活、CMC酶活、β-葡萄糖苷酶活進(jìn)行測定，初步篩選出產(chǎn)纖維素酶活力較高的A25菌株。初步試驗(yàn)表明，在50℃反應(yīng)時(shí)間30min，pH5.5時(shí)A25菌株產(chǎn)生的纖維素酶的活性有較大提高。建議對(duì)A25進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)，以探明其最適的產(chǎn)酶條件，或?qū)ζ溥M(jìn)行進(jìn)一步的誘變，以提高其酶活性應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。
溫度對(duì)纖維素酶活性的影響
從粗酶液中吸粗酶液2mL和2mL DNS和1mL蒸餾水加入試管中，在不同的水浴溫度下水浴處理30min后，對(duì)菌體的產(chǎn)酶量進(jìn)行檢測。為了確定酶活的最適溫度，通過測40～80℃不同溫度下的實(shí)驗(yàn)確定酶活，不同培養(yǎng)溫度對(duì)纖維素酶有不同的影響，結(jié)果表明，曲霉A25水浴處理在40℃時(shí)酶活力表現(xiàn)較低，50℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值，水浴處理溫度超出50℃時(shí)酶活力逐漸變小。對(duì)于纖維素酶活的最適溫度為50℃，即纖維素酶產(chǎn)量的最適溫度在50℃。
相關(guān)新聞推薦
1、生長曲線分析儀監(jiān)測下吲哚對(duì)惡臭假單胞菌 ΔttgABC 突變體抗生素耐受的影響（二）
2、高產(chǎn)蛋白酶乳酸桿菌高效篩選方法、生長曲線測定及耐受能力分析（一）
3、火山土壤對(duì)微生物群落多樣性的塑造、苧麻根際土壤微生物的影響