培養(yǎng)基的統(tǒng)計參數(shù)設(shè)計（L27）
將鼠李糖乳桿菌細(xì)胞在MRS肉湯中培養(yǎng)，并以4%（v/v）接種至每種培養(yǎng)基中。使用L27（313）設(shè)計評估MRS培養(yǎng)基中10種成分對鼠李糖乳桿菌生長的影響。研究中的因素如表1所示。每個實驗重復(fù)三次。
通過Box-Behnken設(shè)計優(yōu)化培養(yǎng)基組成
基于正交設(shè)計實驗對生物量顯著變量的選擇，選擇以下顯著變量：蛋白胨（X1）、葡萄糖（X2）和MnSO4·H2O（X3）。一旦選擇相關(guān)變量的范圍，使用Box-Behnken設(shè)計確定這些變量對生物量的最佳濃度。使用統(tǒng)計軟件包制定總共17個實驗。所有變量的中心值編碼為零。
MRS培養(yǎng)基中微量元素的影響
基于正交設(shè)計實驗（L27）對生物量不顯著變量的選擇，設(shè)計培養(yǎng)基組成實驗如下：原始MRS、優(yōu)化MRS（OPT）、無檸檬酸銨、或無K2HPO4、或無CH3COONa、或無MgSO4、以及無MRS中四種元素（mini-MRS）。微量元素對特定生長速率和最大生物量的影響參考先前的生長動力學(xué)分析方法。
衰減全反射傅里葉變換紅外光譜
使用Thermo Nicolet Nexus FTIR儀器在中紅外區(qū)域400 cm-1至4000 cm-1進(jìn)行衰減全反射傅里葉紅外光譜（ATR-FTIR）分析，掃描速度為16。為制備樣品，將凍干細(xì)菌重懸于磷酸鹽緩沖溶液（PBS）中并調(diào)整至相同OD600為10。將該懸浮液50μl允許在附著于分光光度計的金剛石晶體上空氣干燥。FTIR光譜在波數(shù)區(qū)域800-1800 cm-1進(jìn)行，隨后使用SigmaPlot 10.0進(jìn)行分析。
SDS-PAGE和聚類分析
對在不同培養(yǎng)基中于37°C培養(yǎng)6小時或24小時的鼠李糖乳桿菌ZY細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE分析。細(xì)胞在去離子水中洗滌，在4°C下以8000 xg離心10分鐘，并以3至5倍稀釋重懸于去離子水中。細(xì)胞在35 Kpsi下通過均質(zhì)器破碎兩個循環(huán)，然后將全細(xì)胞蛋白質(zhì)在-20°C下儲存用于后續(xù)實驗。凝膠制備使用0.1% SDS的12%分離膠和4%堆積膠。Tris-甘氨酸緩沖液（pH 8.3）含0.1% SDS作為電極緩沖液。樣品用樣品緩沖液處理并在100°C加熱5分鐘，然后上樣至凝膠。在Bio-Rad迷你凝膠電泳單元中，在室溫下以每板20 mA恒定電流從陰極到陽極進(jìn)行電泳，蛋白質(zhì)通過考馬斯亮藍(lán)R-250染色顯影。在樣品制備中將蛋白質(zhì)樣品調(diào)整至相同細(xì)胞密度或蛋白質(zhì)濃度。采用高斯模型的Quantity One分析用于通過SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白質(zhì)。通過比較MRS、OPT和mini-MRS實驗，使用雙向?qū)哟尉垲惙椒ㄓ嬎泔@著差異，使用PermutMatrix軟件如Donnini等人先前所述。
結(jié)果與討論
益生菌篩選
分離菌株ZY為桿狀、革蘭氏陽性，具有白色光滑菌落，并在靜態(tài)條件下燒瓶發(fā)酵期間具有產(chǎn)生乳酸的能力。基于這些結(jié)果，該菌株被鑒定為乳酸菌。16S rRNA序列表明分離菌株與鼠李糖乳桿菌密切相關(guān)?；谧钕嚓P(guān)物種16S rRNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析（圖1），該菌株被鑒定并命名為鼠李糖乳桿菌ZY（登錄號KC012630）。該新菌株與鼠李糖乳桿菌LR2（登錄號AY675254）相似度為99.1%，與玉米乳桿菌NRIC1947（登錄號AB362765）相似度為97%，與副干酪乳桿菌NRIC0638（登錄號AB362702）相似度為96.7%。
由于食品市場需求，開發(fā)更有效分離和表征新型益生菌株的方法并實現(xiàn)比已商業(yè)化菌株更好的益生特性非常重要。因此，我們的目標(biāo)是使用商業(yè)益生菌產(chǎn)品篩選新菌株。通過對近完整16S rRNA樣本測序，兩個菌株分別被鑒定為鼠李糖乳桿菌和植物乳桿菌。由于生長能力和活力是益生作用和商業(yè)應(yīng)用的重要前提，首先對兩個菌株通過發(fā)酵研究其生長特性。鼠李糖乳桿菌ZY在發(fā)酵過程中顯示出更快的生長速率和更高的生物量（數(shù)據(jù)未顯示）。此外，由于已知并非所有乳酸菌都具有賦予宿主健康益處的能力，因此有必要對大量菌株進(jìn)行表征以獲得理想益生菌。因此，這些菌株也進(jìn)行了功能表征。鼠李糖乳桿菌ZY在酸性pH、溶菌酶或H2O2中存活的更優(yōu)異能力也得到確認(rèn)。這兩種能力被認(rèn)為是益生作用的重要前提。因此，選擇具有更好益生潛力的鼠李糖乳桿菌ZY進(jìn)行進(jìn)一步研究。
通過統(tǒng)計分析的L27培養(yǎng)基對細(xì)胞生長的影響
表1所示的正交實驗設(shè)計（L27）包括10種成分的三個水平MRS，用于評估培養(yǎng)基效果。24小時生物量的OD600變化范圍從0.76到1.89，分別對應(yīng)運行7和運行2（表2）。
在運行2中觀察到最高特定生長率，即μmax=0.46 h-1。結(jié)果表明，較高濃度的蛋白胨、酵母浸膏和葡萄糖是培養(yǎng)基中導(dǎo)致更高生物量生長的關(guān)鍵因素。使用表3中的應(yīng)用ANOVA分析，蛋白胨、酵母浸膏和MnSO4·H2O對特定生長率有顯著影響，置信P值<0.05。葡萄糖和MnSO4·H2O是關(guān)于生物量生長的兩個主要因素（P<0.05）。
較高的微生物生長主要歸因于作為氮源的蛋白胨和作為碳源的葡萄糖，它們是MRS培養(yǎng)基的主要成分。MnSO4·H2O被認(rèn)為是負(fù)責(zé)生物量和特定生長率的最顯著微量元素。錳是干酪乳桿菌的重要生長因子，因為它負(fù)責(zé)重要的乳酸脫氫酶。另一方面，鎂也刺激雙發(fā)酵乳桿菌的生長，不可否認(rèn)的證據(jù)表明鎂與正常細(xì)胞增殖直接相關(guān)，刺激DNA和蛋白質(zhì)合成。此外，對于缺乏超氧化物歧化酶的物種（如植物乳桿菌），通過增加微生物的氧化應(yīng)激抵抗力，鎂對其最佳發(fā)酵和需氧生長至關(guān)重要。
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