仿刺參(Apostichopus japonicus)是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)海水品種。自2003年開(kāi)展“北參南養(yǎng)”試驗(yàn)以來(lái)，仿刺參養(yǎng)殖在南方取得蓬勃發(fā)展，福建省已成為我國(guó)南方重要的仿刺參養(yǎng)殖產(chǎn)區(qū)，在“北參南養(yǎng)”過(guò)程中，疾病問(wèn)題一直是制約養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的難題。本研究從仿刺參腸道內(nèi)容物中分離獲得一株植物乳桿菌，對(duì)菌株生長(zhǎng)特性、產(chǎn)酸能力等益生特性進(jìn)行分析，為水產(chǎn)用益生菌制劑研發(fā)提供備選菌株，為更好地開(kāi)發(fā)和應(yīng)用益生菌制劑提供理論支撐。
實(shí)驗(yàn)步驟
細(xì)菌濃度和吸光度值的線性相關(guān)曲線
以無(wú)菌培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L.plantarum培養(yǎng)液。在波長(zhǎng)600 nm分別測(cè)定系列稀釋菌懸液的OD值，制作菌濃度與OD值的關(guān)系曲線，獲得線性關(guān)系方程式。
不同條件下培養(yǎng)菌株HY21
MRS液體培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)不同pH和不同NaCl添加量，分別接種2%種子液，在不同溫度條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600值。根據(jù)1.2線性方程式，計(jì)算結(jié)果繪制圖表。
菌株的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸能力的測(cè)定
將L.plantarum HY21培養(yǎng)液以2%接種于MRS液體培養(yǎng)基，30°C恒溫厭氧培養(yǎng)。前12 h每1 h取樣一次，后20 h每2 h取樣一次。測(cè)定培養(yǎng)液在600 nm處吸光度值并測(cè)定培養(yǎng)液pH。
結(jié)果與分析
細(xì)菌濃度和吸光度值的線性相關(guān)曲線
L.plantarum HY21的細(xì)菌濃度與OD值之間相關(guān)線性關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。在波長(zhǎng)為600 nm下，當(dāng)吸光度值介于0.054 0–0.848 6之間時(shí)，L.plantarum HY21細(xì)菌濃度與吸光度值之間線性關(guān)系良好，建立的回歸方程為Y=0.027 34X+0.039 11(R2=0.997 6)。
植物乳桿菌的培養(yǎng)條件和產(chǎn)酸能力
由圖2所示，當(dāng)pH 4.0–9.0時(shí)，植物乳桿菌HY21生長(zhǎng)迅速，能大量繁殖。菌株在強(qiáng)酸強(qiáng)堿環(huán)境下生長(zhǎng)狀態(tài)明顯受到抑制，對(duì)pH 4.0和pH 10.0等環(huán)境具有一定的耐受性。在15°C低溫條件和55°C高溫條件下，生長(zhǎng)完全受到抑制，在20–45°C條件下，菌株能夠良好生長(zhǎng)。在添加1.0%、1.5%NaCl的MRS培養(yǎng)基中，菌株不受影響能正常生長(zhǎng)。當(dāng)添加NaCl含量大于3.0%時(shí)，生長(zhǎng)效果逐漸次之。當(dāng)NaCl添加量達(dá)到8.0%時(shí)，生長(zhǎng)受到抑制，菌體無(wú)法增殖。在接種2 h后，迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，9 h后生長(zhǎng)速度變緩，14 h時(shí)到達(dá)最大生長(zhǎng)量。0–10 h內(nèi)，菌液pH從5.6快速下降至3.8。18 h后菌液pH變化趨于平緩，基本穩(wěn)定在3.6左右。L.plantarum HY21可以在14 h內(nèi)達(dá)到最大生長(zhǎng)量和較低的pH。綜上所述，L.plantarum HY21在pH 5.0–8.0的環(huán)境中生長(zhǎng)狀態(tài)最佳，耐溫范圍較廣，14 h內(nèi)達(dá)到最大生長(zhǎng)量和較低的pH。
圖1植物乳桿菌HY21的細(xì)菌濃度-吸光度的線性相關(guān)曲線
植物乳桿菌對(duì)模擬胃腸液、海鹽溶液、膽汁的耐受性
表1比較了L.plantarum HY21在不同外環(huán)境脅迫下的存活情況。在pH 3.0的人工胃液和pH 6.8的人工腸液中3 h后，L.plantarum HY21存活率分別為118.83%±7.42%和103.85%±3.42%。在不同pH的人工胃腸液中處理不同時(shí)間后，所檢測(cè)到的L.plantarum HY21活菌數(shù)隨著pH降低而明顯減少；而且經(jīng)pH 2.5處理，隨著時(shí)間延長(zhǎng)活菌數(shù)顯著減少；但經(jīng)pH 3.0處理，隨時(shí)間延長(zhǎng)菌數(shù)沒(méi)有明顯變化。植物乳桿菌HY21在3%海鹽溶液中處理不同時(shí)間后，所檢測(cè)到的活菌數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)并沒(méi)有明顯差異；在處理16 h后存活率仍為97.58%±7.14%。隨著膽汁濃度的增加，植物乳桿菌HY21的活菌數(shù)逐漸減少，存活率逐漸降低；在2.5%、5.0%、10%膽汁環(huán)境下，存活率分別為89.43%±1.27%、87.74%±6.23%、68.11%±7.98%。
圖2不同初始條件下植物乳桿菌HY21的生長(zhǎng)量(A?C)和植物乳桿菌HY21的生長(zhǎng)與pH變化曲線(D)
表1植物乳桿菌HY21在不同溶液中的存活率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3)
討論
不同來(lái)源植物乳桿菌的生長(zhǎng)特性
對(duì)比不同來(lái)源植物乳桿菌的生長(zhǎng)曲線與產(chǎn)酸曲線發(fā)現(xiàn)，大部分植物乳酸桿菌的生長(zhǎng)延滯期較短，大多在2 h后迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)期，且產(chǎn)酸較多，大多數(shù)進(jìn)入穩(wěn)定期時(shí)pH小于4.0[14-19]。本試驗(yàn)菌株HY21的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線與豬源植物乳酸桿菌GF103[14]的研究結(jié)果相似，2 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，9 h進(jìn)入穩(wěn)定期，穩(wěn)定后pH在3.6左右，至20 h進(jìn)入穩(wěn)定期末期，菌量才出現(xiàn)下降。該結(jié)果表明，菌株HY21有較好的穩(wěn)定性和產(chǎn)酸能力。培養(yǎng)后期可以調(diào)節(jié)pH和添加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等方式，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量發(fā)酵產(chǎn)物和菌體。
表2植物乳桿菌HY21對(duì)4株病原菌的抑制作用
圖3植物乳桿菌HY21對(duì)4株病原菌的抑制平板
圖4植物乳桿菌HY21清除3種自由基的能力和還原力的比較分析不同小寫(xiě)字母之間表示差異顯著，相同字母之間表示差異不顯著
溫度是微生物生命活動(dòng)中重要的環(huán)境因子，當(dāng)溫度改變時(shí)，微生物必須通過(guò)調(diào)節(jié)脂類(lèi)的組成、胞內(nèi)酶的活性、蛋白質(zhì)的合成、基因調(diào)控和RNA的合成以適應(yīng)環(huán)境溫度的變化。溫度不僅影響乳酸菌的生長(zhǎng)，還影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。Fu等[17]從泡菜中分離出植物乳酸桿菌ZJ2868，該菌在20–45°C的溫度范圍內(nèi)均能正常生長(zhǎng)，屬于中溫性乳酸菌。菌株HY21在30°C時(shí)生長(zhǎng)效果最佳，在20–45°C能夠良好生長(zhǎng)，與溫度對(duì)菌株ZJ2868的生長(zhǎng)影響規(guī)律一致，也屬于中溫性乳酸菌。
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