魚類是一種營養(yǎng)豐富的食物來源，因其多種營養(yǎng)價值而被推薦使用。它的飽和脂肪含量低，富含多不飽和脂肪酸(PUFA)和蛋白質(zhì)。然而，鮮魚在被屠宰后質(zhì)量很容易變差。大多數(shù)魚類被消化酶和脂肪酶、微生物腐敗和表面細(xì)菌氧化降解。熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌是革蘭氏陰性細(xì)菌，被認(rèn)為是魚和魚產(chǎn)品冷藏過程中常見的特定腐敗生物。近年來，研究人員付出了相當(dāng)大的努力來尋找天然防腐劑，以減緩或抑制魚類中細(xì)菌和真菌的生長。同時，越來越多的消費者意識到合成防腐劑對健康的潛在負(fù)面影響和天然添加劑的好處，這促使食品行業(yè)尋求天然產(chǎn)品作為替代品。許多來自植物的防腐劑已被證明具有抗氧化或抗菌特性。瑞香素（7,8-二羥基香豆素）是來源于植物的香豆素的二羥基衍生物。它是從韓國達芙妮中提取的植物活性元素，已報道具有抗微生物，抗氧化，抗瘧藥，抗凝，和免疫調(diào)節(jié)活性。然而，瑞香素對食源性腐敗菌的潛在影響鮮有報道。因此，熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌，作為魚和魚制品中的特定腐敗菌（SSOs），被選作目標(biāo)的細(xì)菌，以評估對營養(yǎng)細(xì)胞瑞香素的抗菌活性和作用機制，以提供一個基礎(chǔ)，瑞香素在食品替代化學(xué)防腐劑行業(yè)。
應(yīng)用Bioscreen全自動生長曲線分析儀在30°C培養(yǎng)基中測試細(xì)菌的生長曲線。細(xì)菌在培養(yǎng)基中生長至OD值為0.1，然后將150uL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到100孔微量滴定板（Bioscreen，芬蘭）的每個孔中。細(xì)菌懸液分別與1×、2×和4×MIC瑞香素混合。0×MIC用作對照。細(xì)菌在30°C下進一步培養(yǎng)，并使用自動微生物生長曲線分析儀在600 nm處監(jiān)測細(xì)胞生長。以時間為橫坐標(biāo)，OD 600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。
實驗結(jié)果：本研究報道了瑞香素對熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的抗菌活性及其作用機制。瑞香素對熒光假單胞菌的MIC為0.16 mg·mL-1，對腐敗希瓦氏菌的MIC為0.08 mg·mL-1。瑞香素可以破壞熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的細(xì)胞壁和膜完整性，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)泄漏，影響細(xì)胞內(nèi)的AKP和ATPase活性。SEM和TEM結(jié)果表明，瑞香素誘導(dǎo)形態(tài)學(xué)改變并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物的滲漏。熒光假單胞菌的FTIR光譜和S.putrefaciens起訴瑞香素破壞在膜和導(dǎo)致的生長抑制的核酸和蛋白質(zhì)泄漏磷脂結(jié)構(gòu)熒光假單胞菌和S.putrefaciens?？傮w而言，研究結(jié)果表明，瑞香素是一種很有前途的天然防腐劑，可用作食品工業(yè)中合成防腐劑的潛在替代品，為增強微生物滅活提供了可行的策略。
圖1、瑞香素對熒光假單胞菌(a)和腐敗假單胞菌(b)的生長曲線。繪制了兩種試驗細(xì)菌在不同濃度瑞香素存在下的生長情況，以進一步分析瑞香素的抗菌活性。如圖(a)所示，對照組細(xì)菌的生長與S形生長曲線一致。熒光假單胞菌在沒有瑞香素的情況下快速生長，6小時后開始進入指數(shù)噬菌體，26小時后進入穩(wěn)定期。然而，用1×、2×和4×MIC濃度的瑞香素處理的組完全抑制了細(xì)菌的生長。腐敗假單胞菌（圖(b))不添加瑞香素的情況下，14小時后開始呈指數(shù)期，28小時后進入穩(wěn)定期。加入1×MIC瑞香素后，腐敗假單胞菌的生長速度比對照慢。30 h后抑制作用逐漸減弱，細(xì)菌生長開始進入對數(shù)期。然而，當(dāng)添加2×MIC和4×MIC濃度的瑞香素時，可以完全抑制細(xì)菌的生長。
圖2、堿性磷酸酶(AKP)活性(a)、細(xì)胞內(nèi)核酸(b)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的滲漏(c)、蛋白質(zhì)滲漏(d)以及瑞香素對熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的ATPase活性(e)。
圖3、用瑞香素處理的熒光假單胞菌(a)和腐敗鏈球菌(b)的傅里葉變換紅外(FTIR)光譜。
圖4、熒光假單胞菌（a）和腐敗希瓦氏菌(b)的掃描電子顯微照片（A1–B1，對照；A2–B2，添加1×MIC瑞香素；A3–B3，添加2×MIC瑞香素；A4–B4，添加4×MIC瑞香素。
圖5、熒光假單胞菌（a）和腐敗希瓦氏菌(b)（A1-B1，對照；A2-B2，添加4×MIC瑞香素）的透射電子顯微照片。
總結(jié)：本論文主要研究評估了瑞香素對熒光假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的抗菌活性和作用機制。瑞香素對熒光假單胞菌和腐敗鏈球菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為0.16和0.08 mg·mL-1。應(yīng)用Bioscreen全自動生長曲線分析儀獲得的生長曲線試驗也表明瑞香素具有良好的抗菌作用。細(xì)胞內(nèi)成分滲漏和細(xì)胞活力分析結(jié)果表明，瑞香素破壞了細(xì)胞膜的形態(tài)。根據(jù)掃描電鏡和透射電鏡觀察，處理后的兩株菌體細(xì)胞膜形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，證實了瑞香素對細(xì)胞膜完整性的破壞。研究結(jié)果表明，瑞香素主要通過破壞細(xì)胞膜發(fā)揮抗菌作用，表明其具有作為天然食品防腐劑的良好潛力。
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