ET菌株的基因組測(cè)序和變異分析。使用Sigma GenElute細(xì)菌基因組DNA試劑盒（NA2110）從4-ml ET菌株培養(yǎng)物中提取總共12μg基因組DNA。DNA在Illumina MiSeq儀器上測(cè)序，插入片段大小為795 bp，300 bp雙端讀長(zhǎng)。總共有5,077,282條讀長(zhǎng)通過(guò)Picard Tools（https://github.com/broadinstitute/picard）的質(zhì)量過(guò)濾和比對(duì)，產(chǎn)生約250倍基因組覆蓋度。相對(duì)于參考菌株基因組（NCBI登錄號(hào)NC_010001.1），ET基因組中的序列變異（單核苷酸多態(tài)性[SNPs]和插入缺失）使用基因組分析工具包（GATK）（20）進(jìn)行識(shí)別。
ADH純化和活性測(cè)量。將來(lái)自野生型（WT）和ET菌株的Cphy3925編碼基因通過(guò)連接無(wú)關(guān)克?。?1）克隆到pET-22B(+)中，如前所述（19）。使用引物對(duì)cphy3925F/cphy3925R（表1）克隆帶有C末端His標(biāo)簽的基因，并通過(guò)測(cè)序確認(rèn)。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)（Novagen 70235）中，在50 ml TB培養(yǎng)基（12 g liter-1胰蛋白胨，24 g liter-1酵母提取物，4 ml liter-1甘油）中生長(zhǎng)至OD600為1，通過(guò)添加500μM IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）并在20°C孵育過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)。細(xì)胞沉淀，重懸于裂解緩沖液（50 mM磷酸緩沖液[pH 8]，0.5 M NaCl，10 mM咪唑，15%甘油，1 mM Pefabloc[Sigma 76307]），并通過(guò)超聲處理（Cole-Parmer Vibracell CV33）與溶菌酶（Novagen 71230）裂解。從50 ml培養(yǎng)物中在鎳-氮川三乙酸（Ni-NTA）離心柱（Qiagen 31014）上純化His標(biāo)簽蛋白，并在12%SDS-PAGE凝膠（Novex 12%Bis-Tris gel NP0342BOX）上可視化。酶活性如參考文獻(xiàn)22所述在100μl 100 mM Tris-HCl(pH 8)中測(cè)量，含有輔因子[0.2 mM NADH(P)H或2 mM NAD(P)+]和適當(dāng)?shù)孜铮?00μM乙酰輔酶A[acetyl-CoA]或CoA，18 mM乙醛，2 M乙醇）。NAD(P)H在室溫下使用SAFAS UVmc2分光光度計(jì)測(cè)量340 nm吸光度（消光系數(shù)6.22 mM-1·cm-1）。
質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)化。pQexpE衍生自pQexp（23），這是一種在大腸桿菌（200μg ml-1紅霉素）和C.phytofermentans（平板上40μg ml-1紅霉素，液體培養(yǎng)中200μg ml-1紅霉素）中穩(wěn)定復(fù)制并帶有紅霉素選擇性的質(zhì)粒。為了構(gòu)建pQexpE，使用引物對(duì)pdcAdhB_F/pdcAdhB_R（表1）從pES120（24）PCR擴(kuò)增Z.mobilis的pdc和adhB基因，并克隆到pQexp的獨(dú)特BamHI和PvuI位點(diǎn)。使用引物對(duì)pQexp_F/pQexp_R通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入。pQexpE通過(guò)供體菌大腸桿菌S17-1接合轉(zhuǎn)移至C.phytofermentans。接合操作如參考文獻(xiàn)23和25所述，不同之處是使用聚醚砜膜支持50-μl培養(yǎng)物混合物，并且在交配后僅使用萘啶酸（不含甲氧芐啶）來(lái)選擇對(duì)抗大腸桿菌。通過(guò)使用引物對(duì)pQexp_F/pQexp_R進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增2.9-kb的pdc-adhB操縱子，確認(rèn)含有pQexpE的陽(yáng)性C.phytofermentans轉(zhuǎn)接合子。
核苷酸序列登錄號(hào)。ET基因組的FASTQ格式DNA測(cè)序文件已提交至歐洲核苷酸檔案庫(kù)，主要登錄號(hào)為PRJEB7255。
結(jié)果與討論
乙醇耐受性C.phytofermentans菌株的分離與生理學(xué)。在補(bǔ)充了0、2、4、6或7%（體積/體積）乙醇的培養(yǎng)物中監(jiān)測(cè)野生型（WT）C.phytofermentans的生長(zhǎng)（圖1A），并計(jì)算了代時(shí)（小時(shí)）和最大細(xì)胞密度（OD600）。WT菌株培養(yǎng)物在0%乙醇和2%乙醇中生長(zhǎng)相似，但在4%乙醇中生長(zhǎng)顯著抑制，在6%和7%乙醇中幾乎觀察不到生長(zhǎng)。相比之下，ET菌株在4%、6%和7%乙醇中生長(zhǎng)，在7%乙醇中的最大細(xì)胞密度（OD600）與WT菌株在4%乙醇中的相似。
雖然ET菌株更耐乙醇，但它在不添加乙醇的培養(yǎng)物中比WT菌株生長(zhǎng)更慢，并且細(xì)胞產(chǎn)量降低（圖1）。ET菌株的葡萄糖消耗也慢于WT菌株，反映了降低的生長(zhǎng)速率。當(dāng)在30 g liter-1葡萄糖上生長(zhǎng)時(shí)，ET菌株在200小時(shí)內(nèi)僅消耗20 g liter-1底物，而WT菌株在不到150小時(shí)內(nèi)完全耗盡葡萄糖。因此，ET菌株在高乙醇濃度下增強(qiáng)的生長(zhǎng)伴隨著標(biāo)準(zhǔn)條件下生長(zhǎng)的減少，支持了ET菌株具有改變生理學(xué)的觀點(diǎn)，與適應(yīng)5%乙醇的C.thermocellum結(jié)果相似（26,27）。然而，我們未觀察到在GS2瓊脂平板上生長(zhǎng)的ET和WT菌落或在液體GS2培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞之間存在形態(tài)學(xué)差異。
ET菌株每單位糖消耗產(chǎn)生的乙醇也少于WT菌株。例如，當(dāng)在纖維素、纖維二糖和葡萄糖上生長(zhǎng)時(shí)，ET菌株的乙醇產(chǎn)量（每摩爾葡萄糖當(dāng)量消耗產(chǎn)生的產(chǎn)物摩爾數(shù)）相對(duì)于WT菌株降低了25%至50%（圖2A），而菌株的乙酸產(chǎn)量相似（圖2B）。我們還測(cè)量了在補(bǔ)充了0、3.75或7%乙醇的纖維二糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的WT和ET培養(yǎng)物的纖維二糖消耗以及主要發(fā)酵產(chǎn)物乙醇、乙酸和甲酸的形成（圖2C）。WT菌株的乙醇產(chǎn)量在3.75%乙醇時(shí)顯著降低，并且在7%乙醇時(shí)纖維二糖消耗和發(fā)酵停止。相比之下，ET菌株的纖維二糖消耗和乙醇產(chǎn)量?jī)H隨乙醇補(bǔ)充量的增加而輕微下降，證明了乙醇抗性表型的穩(wěn)健性?？傊?，這些結(jié)果突出了ET菌株在高乙醇濃度下代謝和產(chǎn)生乙醇的表型優(yōu)勢(shì)，但也表明這些優(yōu)勢(shì)是以在低環(huán)境乙醇濃度下較低的乙醇產(chǎn)量和較慢的生長(zhǎng)為代價(jià)的。
乙醇耐受性梭菌菌株生長(zhǎng)、基因組學(xué)、途徑工程及發(fā)酵特性（一）
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