討論
碳水化合物的利用以及調(diào)節(jié)糖分解代謝的整體調(diào)控途徑與許多重要病原體的持久存在和毒力密切相關(guān)，包括變形鏈球菌、化膿性鏈球菌和肺炎鏈球菌?？谇坏奈⑸锶郝浒瑪?shù)百種細菌系統(tǒng)型，依賴于這些生物膜中有限營養(yǎng)物質(zhì)的細菌之間存在激烈的種間競爭?？谇还采涂谇徊≡w之間的相互作用對于決定牙菌斑的“健康”或“致病”狀態(tài)至關(guān)重要。雖然在大多數(shù)低G+C革蘭氏陽性菌中，CcpA及其輔阻遏物HPr-Ser-P是CCR的主要效應(yīng)物，但CcpA非依賴性CCR在變形鏈球菌中主導(dǎo)著多種分解代謝途徑的調(diào)節(jié)，包括fruAB、levDEFG以及纖維二糖和乳糖操縱子。這些在變形鏈球菌中的觀察結(jié)果提出了一個問題：這種病原體中CCR的進化是變形鏈球菌獨有的，還是可能反映了以口腔組織為自然棲息地的生物體在CCR控制上的普遍分歧？從本研究來看，至少一種豐富的共生菌以與變形鏈球菌相似的方式調(diào)控兩個同源的CCR敏感操縱子的表達，但在ManL和CcpA調(diào)節(jié)碳水化合物利用的作用方面存在一些顯著差異（圖4）。
本研究中構(gòu)建的各種突變體的表征證明了fruA、levDEFG和manL的表觀同源物在變形鏈球菌和戈登氏鏈球菌之間的功能和調(diào)控具有高度保守性。與變形鏈球菌中的發(fā)現(xiàn)相似，F(xiàn)ruA是戈登氏鏈球菌利用果糖聚合物所必需的，而levDEFG操縱子主要負責(zé)果糖的內(nèi)化。也與變形鏈球菌相似，EIIMan的底物似乎包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖，甚至果糖。重要的是，變形鏈球菌中表達fruA和levDEFG操縱子所必需的LevQRST系統(tǒng)在戈登氏鏈球菌中序列和功能都是保守的。具體來說，失活levR基因（編碼該四組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的響應(yīng)調(diào)節(jié)器）導(dǎo)致誘導(dǎo)底物對兩個操縱子的完全激活喪失（數(shù)據(jù)未顯示）。因此，這些模型基因及其調(diào)控元件的高度保守性使得能夠可靠地對比兩種生物之間的CCR調(diào)控途徑。
許多研究支持CcpA在戈登氏鏈球菌的分解代謝物抑制和碳水化合物依賴性基因表達調(diào)節(jié)中的作用，并且已證明CcpA可以結(jié)合該生物體中的CRE序列來影響靶基因的轉(zhuǎn)錄變化。這些包括CCR敏感的精氨酸脫亞胺酶(AD)基因，它們在葡萄糖存在下被緊密抑制。CcpA的失活導(dǎo)致AD表達對葡萄糖敏感性的顯著喪失，刪除arcA基因5'端的CRE序列也是如此，支持經(jīng)典的CcpA依賴性基因表達途徑在戈登氏鏈球菌中是有功能的。戈登氏鏈球菌中CcpA介導(dǎo)的葡萄糖依賴性基因表達調(diào)節(jié)的其他例子包括淀粉酶結(jié)合蛋白A基因(abpA(41))。相比之下，雖然CcpA的缺失對變形鏈球菌的基因表達有全局性影響，但僅在非常特定的體外條件下證明了ccpA突變體中對基因CCR的微小影響。否則，沒有證據(jù)表明在誘導(dǎo)和抑制底物組合存在下生長時，ccpA突變體中CCR得到緩解，無論是在基因表達水平還是通過評估突變菌株的二次生長。這一陳述也適用于變形鏈球菌的胍丁胺脫亞胺酶(AgD)途徑。AgD系統(tǒng)在生化方面和表達調(diào)控上與戈登氏鏈球菌的AD途徑高度相似，兩者都需要底物誘導(dǎo)并且對CCR敏感。然而，與戈登氏鏈球菌中的AD基因不同，變形鏈球菌中CcpA的失活并未緩解AgD基因表達的CCR。
盡管我們能夠創(chuàng)造出可以證明CcpA對fruA和levD表達產(chǎn)生影響的條件，但在戈登氏鏈球菌中這些基因啟動子區(qū)域附近缺乏CRE序列意味著觀察到的CcpA對這些操縱子的微小影響是間接的。相比之下，變形鏈球菌中fruA的表達可以通過CcpA結(jié)合fruA啟動子附近的兩個CRE來控制。本文提供的工作首次證明CcpA非依賴性CCR在口腔共生菌響應(yīng)碳水化合物的基因調(diào)節(jié)中起主要作用。具體來說，刪除manL對二次生長的影響最為深遠，并導(dǎo)致在所有測試的碳水化合物中fruA和levD的高水平表達。值得注意的是，戈登氏鏈球菌中ccpA的失活導(dǎo)致fruA和levD操縱子的表達水平降低。我們的數(shù)據(jù)證明CcpA對抑制的影響可以在ManL缺陷型菌株中被消除，并且使用mRNA測量和基因融合證明CcpA抑制manL表達，表明CcpA對levD和fruA轉(zhuǎn)錄的影響幾乎完全歸因于CcpA在manL負向調(diào)節(jié)中的作用。ManL效應(yīng)CCR的機制尚未明確確定，但現(xiàn)有證據(jù)表明，與調(diào)節(jié)蛋白的變構(gòu)相互作用或涉及ManL以及可能的其他PTS組分的磷酸中繼可能是ManL依賴性CCR的潛在機制。
本研究的另一個重要發(fā)現(xiàn)是，在ccpA突變體中觀察到Ser46磷酸化HPr蛋白的量急劇增加。將manL突變引入ccpA突變體菌株逆轉(zhuǎn)了這種效應(yīng)，雙突變體的Ser-46-HPr水平較低，但總體HPr蛋白水平（圖3）高于野生型菌株。由于在ccpA突變體中fruA和levD基因的CCR增強，而在ccpA manL背景中被消除，這一發(fā)現(xiàn)提出了HPr-Ser-P也可能是戈登氏鏈球菌中這些模型基因的CcpA非依賴性CCR效應(yīng)物的可能性，類似于我們最近在變形鏈球菌中的報道。我們提出ManL和HPr-Ser-P都參與戈登氏鏈球菌的CCR，因為單獨刪除manL并未引起HPr-Ser-P水平的任何變化（圖3）。此時不能排除ManL通過調(diào)節(jié)HPr基因ptsH的表達和活性來影響CCR的可能性。然而，我們實驗室先前報道，在變形鏈球菌的manL突變體中可以觀察到ptsH和ptsI(EI)基因表達的altered expression。
本研究還揭示了變形鏈球菌和戈登氏鏈球菌之間CCR調(diào)節(jié)的另一個重要差異。在變形鏈球菌中，通過PTS滲透酶施加的CCR顯示出明顯的糖特異性，當(dāng)存在各個滲透酶的同源或偏好碳水化合物時，對CCR的影響更大。例如，EIIABMan主要在葡萄糖和甘露糖存在時賦予CCR，這與其在葡萄糖和甘露糖攝取中的作用一致，而FruI和EIILev僅在其偏好底物果糖存在時有效施加CCR。因此，有人提出，未磷酸化的EII蛋白（當(dāng)EII參與傳入碳水化合物的磷酸轉(zhuǎn)移時存在）通過變構(gòu)相互作用調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活因子LevR的活性，從而控制fruA和levDEFG的表達。在戈登氏鏈球菌中，ManL依賴的CCR似乎對生長碳水化合物的性質(zhì)相對不敏感。例如，在葡萄糖、果糖、半乳糖或甘露糖存在下，fruA和levD的表達在manL突變體背景中相似地升高（表3和4）。一個可能的解釋是，這種觀察源于戈登氏鏈球菌中EIIMan復(fù)合物比變形鏈球菌具有更廣泛的底物特異性。特別是，PTS測定（圖2）表明ManL可能參與葡萄糖、甘露糖和半乳糖的轉(zhuǎn)運，并且在manL突變體中果糖-PTS活性略有增加，這可能是由于LevDEFG復(fù)合物表達升高所致。由于manL突變體在果糖上也生長較慢，因此ManL也可能內(nèi)化果糖。相應(yīng)地，在manL突變體生長于菊粉（必須水解成果糖才能被細菌利用）時，fruA和levD的表達增強。因此，戈登氏鏈球菌中CCR對特定糖源的相對獨立性可能與ManL在戈登氏鏈球菌中比在變形鏈球菌中有效內(nèi)化更多底物的能力有關(guān)。值得注意的是，在甘露糖上生長的manL突變體中fruA和levD基因的表達水平幾乎與菊粉上相同，這可能是由甘露糖通過果糖/甘露糖特異性酶II LevDEFG復(fù)合物在manL突變體中轉(zhuǎn)運所誘導(dǎo)的。不過需要強調(diào)的是，ManL的缺失也可能導(dǎo)致利用多種偏好糖的能力降低，這可能導(dǎo)致糖酵解中間體減少，進而導(dǎo)致HPr-Ser-P水平降低。雖然情況似乎并非如此（圖3），但不能排除ManL缺陷的影響部分源于HPr的量或磷酸化狀態(tài)的改變。
本研究揭示的口腔鏈球菌CCR復(fù)雜性的另一個維度是ManL影響其自身操縱子表達的能力。因此，編碼EIIMan滲透酶的manL操縱子的抑制受CcpA和ManL共同控制。基于本文描述的實驗以及我們對變形鏈球菌的研究，似乎當(dāng)碳水化合物濃度相當(dāng)高（3至5 mM）時，CcpA可能會抑制manL和其他基因。
在這種情況下，經(jīng)典的CcpA模型將適用，即細胞監(jiān)測碳水化合物通過糖酵解途徑的流量，通過ATP依賴的HPr激酶調(diào)節(jié)HPr-Ser-P的量。在較低的碳水化合物濃度下，ManL可以響應(yīng)其細胞外底物的可用性來調(diào)節(jié)其自身的產(chǎn)生以及其他滲透酶的水平，通過不過量生產(chǎn)轉(zhuǎn)運蛋白來節(jié)省能量。這種雙層調(diào)節(jié)系統(tǒng)（圖4）可能是在口腔細菌中進化而來的，并且應(yīng)該非常適應(yīng)口腔細菌所面臨的環(huán)境，即長時間依賴于從糖蛋白釋放的低濃度多種碳水化合物，其間穿插著現(xiàn)代飲食中常見的高濃度偏好碳水化合物。我們提出，口腔共生菌戈登氏鏈球菌和口腔病原體變形鏈球菌在調(diào)節(jié)偏好碳水化合物分解代謝方式上的這些細微差異反映了一種生態(tài)位適應(yīng)，這可能使共生菌在有利于牙齒健康的條件下具有競爭優(yōu)勢，而變形鏈球菌在促進致齲菌群和齲齒出現(xiàn)的條件下更有效地優(yōu)化糖的利用。未來的研究將更詳細地檢驗這一假設(shè)。
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