摘要
工業(yè)過(guò)程和含氮肥料的使用導(dǎo)致硝酸鹽污染環(huán)境，這是一個(gè)全球范圍內(nèi)日益嚴(yán)重的問(wèn)題。雖然硝酸鹽可以通過(guò)微生物反硝化作用從污染區(qū)域去除，但硝酸鹽經(jīng)常與其他污染物（如重金屬）共存，這些污染物可能阻礙該過(guò)程。本文使用與橡樹(shù)嶺保護(hù)區(qū)（ORR）污染環(huán)境中觀察到的相似濃度的硝酸鹽和金屬（Al、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Cd和U），從ORR的地下水和沉積物中富集和分離了硝酸鹽還原微生物。對(duì)七種新的耐金屬硝酸鹽還原菌株進(jìn)行了表征，并檢查了它們?cè)贠RR未污染和污染區(qū)域的分布。雖然這七種菌株具有不同的生長(zhǎng)pH范圍、碳源偏好以及對(duì)單個(gè)和組合金屬的耐受程度，但所有菌株在存在和不存在ORR污染環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的金屬混合物的情況下，都能以相似的速率還原硝酸鹽。通過(guò)精確16S RNA序列變異分析，在ORR不同位置的地下水樣品中鑒定出四種菌株，所有四種都出現(xiàn)在未污染和污染區(qū)域。通過(guò)使用環(huán)境相關(guān)金屬濃度，我們成功地從ORR未污染和污染環(huán)境中分離出多種微生物，這些微生物能夠在極端混合金屬污染存在下還原硝酸鹽。
硝酸鹽污染是影響地下水質(zhì)量的全球性問(wèn)題。在某些情況下，地下水同時(shí)被硝酸鹽和重金屬混合物污染可能降低微生物介導(dǎo)的硝酸鹽去除，從而延長(zhǎng)硝酸鹽污染的持續(xù)時(shí)間。本文使用橡樹(shù)嶺保護(hù)區(qū)污染點(diǎn)存在的金屬和硝酸鹽濃度，分離出七種耐金屬菌株。所有菌株都能在高濃度重金屬混合物存在下還原硝酸鹽。七種菌株中的四種位于橡樹(shù)嶺保護(hù)區(qū)的原始和污染點(diǎn)。對(duì)這些硝酸鹽還原菌株的進(jìn)一步研究將揭示耐多種金屬的機(jī)制，增加我們對(duì)硝酸鹽和金屬污染對(duì)地下水微生物群落影響的理解。
人為破壞氮循環(huán)是一個(gè)日益嚴(yán)重的全球性問(wèn)題，導(dǎo)致了多種環(huán)境和人類健康相關(guān)問(wèn)題。特別是，氮基肥料和化石燃料使用的增加導(dǎo)致人類活動(dòng)產(chǎn)生反應(yīng)性氮物種的速率超過(guò)了自然過(guò)程去除它們的速率。這引發(fā)了一系列負(fù)面環(huán)境后果，如沿海富營(yíng)養(yǎng)化、酸雨以及因硝酸鹽污染導(dǎo)致的地下水質(zhì)量下降。消費(fèi)硝酸鹽污染的地下水可能引起嬰兒高鐵血紅蛋白血癥，并可能是特定類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)因素。
橡樹(shù)嶺保護(hù)區(qū)（ORR）位于田納西州，包含一個(gè)高度污染的點(diǎn)，同時(shí)含有硝酸鹽和多種重金屬。這源于1951年至1983年期間，ORR Y-12工廠的核處理活動(dòng)將酸性含鈾和硝酸鹽廢物排放到四個(gè)容量為950萬(wàn)升的池塘中。1978年，池塘中的液體pH值范圍為0.8至5.3，硝酸鹽濃度高達(dá)74 g/升（1.2 M），同時(shí)含有高濃度的各種金屬，包括鋁（4.9 g/升）、錳（0.024 g/升）、鎳（0.13 g/升）以及鈾（0.32 g/升）。1983年，池塘中的液體被中和，resulting污泥沉淀。液體被移除，池塘被覆蓋并改建成停車場(chǎng)。目前有五個(gè)大型污染羽流從所謂的S-3池塘延伸出來(lái)。周圍地下水中的污染物不僅包括硝酸鹽（高達(dá)11.6 g/升，190 mM）和U（140 mg/升），還包括多種金屬，如鋁（560 mg/升）、錳（170 mg/升）和鎳（9.4 mg/升）。因此，ORR S-3池塘是美國(guó)在硝酸鹽和金屬污染方面最嚴(yán)重的點(diǎn)之一。
硝酸鹽通常通過(guò)反硝化作用從土壤和地下水環(huán)境中自然去除，這是一個(gè)厭氧或微好氧呼吸過(guò)程，微生物將還原電子源的氧化與硝酸鹽的還原耦合，而不是氧氣。形成的亞硝酸鹽隨后被亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶和一氧化二氮還原酶分別還原為一氧化氮、一氧化二氮和最終氮?dú)猓M管許多微生物只執(zhí)行途徑中的某些步驟。硝酸鹽還原酶催化反硝化途徑的第一步，有兩種類型。呼吸硝酸鹽還原酶是一種三聚體跨膜蛋白，由narGHI編碼，需要鉬（Mo）以鉬蝶呤鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸（MGD）輔因子形式存在于NarG的活性位點(diǎn)。NarH含有鐵硫簇，而NarI含有細(xì)胞色素b。相反，一些生物含有一種二聚體周質(zhì)硝酸鹽還原酶，由napAB編碼。NapA也需要Mo與MGD輔因子配位，NapB含有細(xì)胞色素c。
已知幾種環(huán)境因素對(duì)土壤中微生物反硝化很重要，包括還原劑來(lái)源以及低氧濃度。土壤pH值也會(huì)影響反硝化，如果pH值低于6.0，會(huì)導(dǎo)致速率降低并形成一氧化二氮作為主要終產(chǎn)物而非氮?dú)狻o可用性也影響土壤中硝酸鹽還原。實(shí)際上，在ORR硝酸鹽污染點(diǎn)，盡管存在高濃度的各種其他金屬，但一些污染最嚴(yán)重的地下水樣品中Mo僅以皮摩爾濃度存在。提出高濃度可溶性Fe和Al在污染環(huán)境中形成沉淀，當(dāng)酸性污染地下水與周圍土壤混合時(shí)。這些沉淀物結(jié)合并吸附鉬酸鹽（Mo的可溶形式），使其無(wú)法被微生物用于硝酸鹽還原。
污染環(huán)境中高濃度金屬是另一個(gè)可能阻礙硝酸鹽還原的因素。采礦作業(yè)廢水通常含有高濃度金屬（如Fe和Ni）以及硝酸鹽（由于使用硝酸銨基炸藥和氰化物作為浸出劑）。當(dāng)研究模擬礦水金屬對(duì)硝酸鹽去除速率的影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)50和100 mg/升Ni分別使其降低18%和65%。不銹鋼生產(chǎn)中的酸洗過(guò)程導(dǎo)致冶金廢水含有高濃度硝酸鹽和各種金屬（包括Fe、Cr和Ni），這些已測(cè)試其對(duì)廢水污泥反硝化的影響。發(fā)現(xiàn)Fe（25 mg/升）和Cr（100 mg/升）降低整體反硝化，而Ni（5 mg/升）導(dǎo)致反硝化中間體（NO2-和N2O）積累。此外，在一項(xiàng)鹽沼沉積物研究中，報(bào)告稱反硝化速率被多種金屬在1 g/升時(shí)降低，包括Pb、Ni、Cr、Zn、Cu、Fe和Cd。結(jié)論是金屬污染可能改變海洋沉積物中氮循環(huán)的動(dòng)態(tài)。
在ORR的先前研究中，使用16S rRNA、nirK和nirS基因序列調(diào)查了未污染和污染環(huán)境中硝酸鹽還原微生物群落，但未分離關(guān)鍵微生物。在本研究中，我們的目標(biāo)是表征能夠在極端金屬污染條件下還原硝酸鹽的土著微生物。然后，我們將使用16S rRNA基因序列庫(kù)映射這些菌株在93個(gè)不同未污染和污染ORR地下水井中的分布。使用基于ORR污染環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的硝酸鹽和金屬混合物濃度，富集并分離出總共七種硝酸鹽還原細(xì)菌菌株。所有七種菌株在生長(zhǎng)于污染ORR環(huán)境金屬混合物（COMM）存在下保持硝酸鹽還原酶活性，并且通過(guò)精確序列變異（ESV）分析，七種菌株中的四種在ORR未污染和污染地下水井中被鑒定。我們提出這些菌株可以作為模型，用于理解在極端污染環(huán)境中高濃度金屬混合物存在下如何減輕硝酸鹽污染。
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