3．缺失株ΔvgrG的構建：
根據(jù)NCBI公布的Kpn vgrG ORF序列(NCBI Reference Sequence:NC_016845.1)設計引物，經(jīng)PCR分別擴增vgrG上下游同源臂序列，再經(jīng)過融合PCR擴增同源臂融合片段。回收純化后的同源臂融合片段和質粒pKO3-Km分別用限制性內切酶NotⅠ進行酶切，再用T4連接酶進行連接，連接產(chǎn)物轉化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定并測序正確。重組質粒pKO3-Km-vgrG轉化入Kpn感受態(tài)細胞，經(jīng)同源重組整合，篩選出構建成功的缺失株KpnΔvgrG。引物序列見表1，引物由蘇州金唯智生物科技合成。
4．回補株CΔvgrG的構建：
根據(jù)NCBI的Kpn基因組序列擴增得到vgrG啟動子及其全基因片段，經(jīng)限制性內切酶KpnⅠ和SalⅠ對質粒pBAD33進行雙酶切，將酶切后的載體與擴增片段通過同源重組酶連接，連接產(chǎn)物轉化到大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)菌液PCR鑒定并測序正確。將重組質粒pBAD33-vgrG轉入ΔvgrG株感受態(tài)細胞，涂板37℃培養(yǎng)至長出單菌落，經(jīng)PCR鑒定含有重組質粒的菌株，即為回補株CΔvgrG。引物序列見表1，引物由蘇州金唯智生物科技合成。
5．生長曲線試驗：
將野生株WT、ΔvgrG株和CΔvgrG株的單菌落分別接種于15 ml LB培養(yǎng)基中，37℃200 r/min培養(yǎng)過夜，次日按1∶100轉接至50 ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃200 r/min振蕩培養(yǎng)。每隔2 h測定菌液A 600值，連續(xù)檢測24 h，每個時間點重復檢測3次。使用軟件GraphPad Prism 8.0繪制生長曲線。
6．沉淀離心試驗(黏度試驗)：
挑取平板菌落至LB液體培養(yǎng)基中(CΔvgrG株培養(yǎng)基加入1.5%阿拉伯糖)，37℃200 r/min培養(yǎng)至A 600值為2.0左右，5 000 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)后吸取上清測定A 600值，比較不同菌株上清的吸光度值以反映菌體黏度。
7．人肺上皮細胞A549黏附試驗：
將2×10 5個A549細胞至24孔細胞板，貼壁后將培養(yǎng)至對數(shù)期的新鮮Kpn菌液按照MOI＝20感染細胞5 h，PBS洗3次，0.5%Triton X-100裂解細胞，裂解液于LB平板培養(yǎng)，統(tǒng)計黏附的細菌克隆數(shù)。
8．小鼠巨噬細胞Raw264.7吞噬試驗：
將Raw264.7細胞鋪于12孔細胞板，細胞密度為5×10 5個/ml。將培養(yǎng)至對數(shù)期的Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株菌液按照MOI＝20感染細胞，感染2 h后更換為含100μg/ml慶大霉素的DMEM培養(yǎng)1 h殺滅胞外菌，最后更換為含10μg/ml慶大霉素的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)6 h和12 h，0.5%Triton X-100裂解細胞，裂解液于LB平板培養(yǎng)，即為胞內存活的細菌克隆數(shù)。
9．小鼠存活率試驗：
Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株以致死劑量1×10 8 CFU經(jīng)鼻腔注射感染小鼠。感染后連續(xù)觀察10 d，統(tǒng)計存活率。
10．小鼠臟器細菌載量試驗：
Kpn WT株、ΔvgrG株和CΔvgrG株以半致死劑量(5×10 7 CFU)經(jīng)鼻腔注射感染小鼠，感染后第3天收集肺臟并研磨，懸液中細菌通過倍比稀釋進行計數(shù)。
11．統(tǒng)計學方法：
應用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件分析，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，采用線性回歸進行相關分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
結果
1．成功構建ΔvgrG株和CΔvgrG株：
以高保真酶PCR擴增出vgrG的上游同源臂和下游同源臂，大小均為524 bp，拼接后連接至自殺載體。自殺載體pKO3-Km-vgrG導入Kpn WT株，經(jīng)同源重組整合，獲得了敲除vgrG的無痕缺失株。經(jīng)特異性引物鑒定，WT株中存在vgrG而缺失株中無法擴增出vgrG序列(圖1)。再以高保真酶PCR擴增出vgrG的啟動子區(qū)域及完整開放閱讀框，大小為3 039 bp，連接至表達載體pBAD33。將pBAD33-vgrG導入ΔvgrG感受態(tài)細胞。經(jīng)特異性引物鑒定，CΔvgrG株構建成功(圖2)。
vgrG同源臂擴增與ΔvgrG株PCR鑒定
注：M：DL2000 marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：上下游同源臂；4：pKO3-Km-vgrG載體鑒定；5：陰性對照；6：WT株；7：ΔvgrG株；8：陰性對照
vgrG序列擴增與CΔvgrG株PCR鑒定
注：M：DL2000 marker；1：vgrG PCR擴增序列；2：pBAD33-vgrG載體鑒定；3：陰性對照；4：WT株；5：ΔvgrG株；6：CΔvgrG株；7：陰性對照
2．vgrG基因缺失后細菌的體外生長能力測定：
為觀察vgrG是否對體外生長產(chǎn)生影響，每2 h用酶標儀測定不同菌株在LB培養(yǎng)基中的A 600值，測至細菌生長平臺期。結果顯示無論在對數(shù)期(4~8 h)還是最終的平臺期(12 h以后)，WT株和ΔvgrG株生長速度沒有顯著區(qū)別[(1.40±0.10)vs(1.20±0.30)，t＝0.63，P>0.05]，ΔvgrG株和CΔvgrG株之間也沒有顯著區(qū)別(P>0.05)。以上結果表明vgrG不參與細菌的體外生長(圖3A)。
細菌體外生長曲線與黏度測定
注：A：細菌體外生長曲線；B：細菌離心后上清液吸光度(A)值
相關新聞推薦
1、微生物的分離培養(yǎng)方法、操作步驟及注意事項——劃線分離法、涂布平板法
2、A型塞內卡病毒全長感染性克隆、致病機理及生長曲線分析（二）
3、UL56基因下游重組病毒對鴨腸炎病毒生物特性、生長曲線影響——材料與方法